电子鼻结合顶空固相微萃取-气质联用法分析微生物脂肪酶对猪肉风味的影响

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(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

电子鼻结合顶空固相微萃取-气质联用法分析微生物脂肪酶对猪肉风味的影响

白雪,杨爽,孟鑫*

(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

用镰刀菌产脂肪酶处理猪肉样品,采用顶空固相微萃取技术对脂肪酶处理前后猪肉样品中的挥发性成分进行萃取,并结合电子鼻和气质联用技术分析鉴定。结果表明:电子鼻能够较好区分脂肪酶处理前后挥发性风味物质成分的变化,主成分分析法(PCA)进一步说明添加微生物脂肪酶能有效地改善猪肉的风味;GC-MS检测出47种挥发性成分,主要为醛类、醇类、酮类、芳香烃类等,这些风味物质的协同作用构成了微生物脂肪酶对猪肉风味特有的贡献,与电子鼻检测结果一致。

脂肪酶,电子鼻,气相色谱-质谱联用,挥发性风味成分

随着人们生活品质的提高,风味肉品愈来愈受到人们的青睐。在确保肉制品安全的前提下,有效提高肉品风味是未来肉制品加工行业发展的趋势。使用食品添加剂提香是常规的处理方法,然而,过多的食品添加剂势必导致肉品营养的破坏。1956年Hewitt等人首次定义了风味酶的概念,并研究了水果和蔬菜的风味形成中酶的功效[1]。近年来,已有研究采用酶制剂的形式添加到肉品中,通过风味酶来改善和强化肉品的风味[2],例如脂肪酶、蛋白酶等,尤其是脂肪酶。脂肪酶广泛应用于油脂加工、食品、皮革、药品、饲料等方面[3],普遍存在于动物、植物和微生物组织中[4],是一种重要的工业酶制剂。

在肉品加工过程中,人工添加脂肪酶具有能使肉品产生独特风味的功效。黄业传等[5]探讨了不同位置的脂肪对猪肉风味的影响,为改善肉品风味提供可靠的研究基础;封莉[6]等将脂肪酶添加到中式香肠中,能有效加速中式香肠中的脂肪降解和脂肪氧化,促进香肠中脂质来源的挥发性风味物质的生成。此外,有研究表明微生物脂肪酶对肉品风味改善有一定的作用,例如,吴若娜[7]将外源脂肪酶添加在腊鸭腿中,能有效促进产品快速成熟,提高鸭腿肉风味;Fernández[8]等研究发现,将胰脂酶添加到发酵香肠中,对风味的形成有促进作用,也可减少成熟时间。本实验室前期研究已从猪肉脂肪组织中提取了内源性脂肪酶,经鉴定能够有效改善猪肉风味[9]。然而,改善猪肉风味是添加内源性脂肪酶,还是外源脂肪酶,研究尚处于探索阶段。为此,本课题拟从土壤中筛选出产脂肪酶的菌株,并将该菌所产脂肪酶添加到猪肉中,考查微生物脂肪酶对猪肉风味的影响并与原猪肉风味进行比较。通过电子鼻和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测微生物脂肪酶处理前后猪肉风味物质的变化情况,以期为风味肉品的研究奠定理论基础,并为肉类产品的深加工提供技术指导。

表1 PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述

1 材料与方法

1.1材料与仪器

土样 共6种,分别为吉林长春地区的钢铁厂G1、肥料厂F2、养殖厂Y3、化工厂H4、辽宁锦州地区的石油化工厂SH5和六厂L6地区营养丰富的土样。猪肉样品 辽宁锦州某超市。

1.2培养基

1.2.1 富集培养基 取酵母膏0.2 g、KH2PO41.5 g、Na2HPO43.5 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、橄榄油10 mL,定容至1000 mL,121 ℃、灭菌20 min。

1.2.2 初筛罗丹明B培养基 取琼脂粉15 g、NaCl 4 g、K2HPO40.5 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO40.4 g、橄榄油乳化液125 mL,定容至1000 mL,121 ℃、灭菌20 min,待培养基冷却后加入1 mL 10 mg/mL罗丹明B溶液,混合均匀后倒入平板。

1.2.3 初始发酵培养基 取蔗糖0.5 g、胰蛋白胨2 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.05 g、(NH4)2SO40.1 g、1 mL橄榄油,定容至100 mL,115 ℃、灭菌15 min。

1.3实验方法

1.3.1 初筛 取1 g土样于10 mL无菌蒸馏水中,振荡混匀。称取3 mL土壤悬液于30 mL富集培养基中,30 ℃、160 r/min振荡培养48 h。取1 mL土壤菌液用无菌蒸馏水梯度稀释至10-8、10-9、10-10三个梯度涂布罗丹明B平板,30 ℃培养72 h,观察平板上菌落生长情况。

1.3.2 复筛 用接种环挑取初筛罗丹明B平板上生长的单菌落进行划线分离,30 ℃培养1 d,将划线上生长的菌落接入到初始发酵培养基中,30 ℃、离心转数160 r/min,培养3 d后,发酵液8000 r/min离心3 min后得到发酵上清酶液,然后测定发酵上清液的脂肪酶酶活。

基于上述三种因素考虑，新时代背景下，安徽财经大学财政学专业在综合国内高校财政学专业设置目标基础之上，主张将财政学专业的人才培养目标定位为：培养具有高度社会责任感，较高思想道德素质、文化素质、身心素质，扎实掌握财政、税务、会计等方面的基础理论知识和实际业务技能，具有较强的求实创新意识和独立思考能力，能够在财政、税务、银行、企业等部门从事财税、财务、管理等相关工作的高层次应用性专门人才。[2]

1.3.3 脂肪酶酶活力测定 发酵液中脂肪酶活力测定采用改进的铜皂法测定[10-12]:25 mL试管中加入橄榄油乳化液(4% PVA溶液150 mL、橄榄油 50 mL,磁力器搅拌3次,每次3 min)2 mL和0.05 mol/L pH7.5磷酸缓冲溶液2.5 mL,40 ℃水浴5 min,再加入0.5 mL发酵上清液,混合均匀,40 ℃振荡15 min后加入6 mol/L HCL溶液1 mL和95%乙醇 6 mL终止反应,混匀后加入3 mL异辛烷并振荡90 s,60 ℃静置10 min,冷却,取上层1 mL异辛烷于25 mL试管中,再加入异辛烷4 mL与铜盐显色剂1 mL,振荡90 s后静置,取上层澄清液用紫外可见分光光度计于714 nm波长下检测吸光度,与标准曲线比较即得脂肪酶活力。酶活力单位(U):在最适条件下,1 min内转化出1 μmoL脂肪酸的酶量称为1个脂肪酶活力单位。

1.3.4 菌种鉴定 菌落的形态学鉴定参考真菌鉴定手册进行观察[13]。分子生物学采用26S rDNA进行序列分析鉴定[14],用DNA抽提试剂盒提取DNA,采用通用引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA AAAG-3′和NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′进行PCR扩增,PCR产物经胶回收纯化后送上海生工生物工程有限公司测序,并对序列进行BLAST分析。通过Clustalx 1.83软件进行多重比对分析后,采用Phylip软件构建系统发育树。

1.3.5 电子鼻检测挥发性物质 取上述发酵上清酶液10 mL与猪肉混合,在4 ℃、pH6条件下浸泡30 min为酶液处理组,另一组为原猪肉,每组25 g,置于300 mL沸水中煮制2 min,两组样品分别取4 g切碎放入烧杯中,迅速加盖密封,20 min后开始测量,每组样品重复测定2次。电子鼻检测[15-16]条件:电子鼻信号的采集时间定为50 s,清洗时间为120 s。PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述见表1。

1.3.6 HS-SPME-GC-MS分析测定挥发性物质 顶空固相微萃取(HS-SPME)[17-18]:称取经切碎的猪肉样品3 g置于20 mL顶空瓶中,加入3 mL饱和氯化钠溶液和磁转子,迅速用聚四氟乙烯隔垫密封,于45 ℃磁力搅拌器中加热平衡10 min,用已活化好的75 μm CAR/PDMS SPME萃取头(270 ℃活化30 min)顶空吸附30 min后,将萃取头插入气质进样口,解吸5 min。每个样品重复测定2次。

GC-MS条件:HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度为250 ℃,不分流模式进样;载气为氦气,流速1 mL/min,不分流模式进样;程序升温:柱初温40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至100 ℃,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。质谱条件为接口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃;离子化方式:EI,电子能量70 eV;质量扫描范围30～550(m/z)。

图4 菌株Y3的26S rDNA系统发育树

1.4数据处理

电子鼻数据分析:取稳定后第47～49 s间的数据信息进行主成分分析(PCA)。GC-MS数据分析:挥发性成分通过计算机检索与Nist和Wiley标准质谱库匹配进行定性分析;采用峰面积归一化法进行定量计算出各挥发性成分的含量。

2 结果与分析

2.1产脂肪酶菌株的筛选

通过富集培养、初筛、发酵复筛[19],以罗丹明B为指示剂,从营养丰富的土样中挑选出产酶活力较高的菌株,图1为菌株的产酶活力情况,从图可以看出部分菌株所产的脂肪酶活力较低,而从养殖厂土样中分离出的菌株所产的脂肪酶活力最高,达到7.6 U/mL,远远高于其他产脂肪酶的菌株,因此选择菌株Y3作为实验分析对象。

图1 产脂肪酶微生物菌株筛选结果

2.2产脂肪酶菌株Y3的鉴定

2.2.1 形态学观察 菌株Y3菌落无固定大小,呈现絮状,不容易挑取;菌落边缘的颜色和结构明显不同,如图2所示,初步确定菌株Y3属于霉菌。

图2 菌株Y3的菌落形态

图3 菌株Y3扩增的片段

2.2.2 分子生物学鉴定 菌株Y3的26S rDNA鉴定电泳结果如图3所示,扩增出约500 bp左右的片段。测序得到的基因序列提交至GenBank,获得登录号为:KX987106。通过GenBank数据库中的基因序列进行BLAST比对分析,与霉菌属(Fusariumsp.)亲缘关系较近,其中与Fusariumtricinctum的同源性达到99%,构建的系统发育树见图4。结合菌株的形态学和分子生物学分析,可将菌株Y3初步确定为霉菌属的镰刀菌(Fusariumtricinctum)。

2.3电子鼻检测微生物脂肪酶对猪肉风味的影响

2.3.1 传感器的响应图结果分析 电子鼻检测微生物脂肪酶Y3处理前后传感器响应变化曲线如图5所示,微生物脂肪酶Y3处理前后猪肉的风味轮廓之间存在着显著差异,响应值变化明显的传感器有R(6)、R(7)、R(8)、R(9),即猪肉中的烷烃类、硫化物、乙醇类、芳香成分和有机硫化物含量有所增加,这在一定程度上表明微生物脂肪酶Y3的添加能够有效提高猪肉香气,改善猪肉风味。

图5 猪肉样品经微生物脂肪酶处理前后传感器响应变化曲线

2.3.2 PCA结果分析 采用PCA(主成分分析)方法对微生物脂肪酶Y3处理前后猪肉中的挥发性风味物质进行分析(图6),图中的每个椭圆代表同批次猪肉风味的数据采集点。从主成分PC1和PC2两个主轴上看,两样品差异显著。其中,第一主成分的方差贡献率为96.65%,第二主成分的方差贡献率为2.29%,贡献率总和达到98.94%,大于95%以上,说明PC1和PC2已经包含足够的信息量,可以代表样品挥发性风味的主要特征。样品差异主要表现在PC1上,其中代表空白样品的信息采集点的椭圆位于效果图左边,代表添加微生物脂肪酶Y3的样品的信息采集点的椭圆向右移动,电子鼻刚好能区分两样品。这一结论表明:添加与未添加微生物脂肪酶Y3的猪肉在香气上存在差别,通过主成分分析方法能有效的区分添加及未添加微生物脂肪酶猪肉样品的风味特征。然而,微生物代谢产生的脂肪酶对猪肉中各种挥发性成分的变化还需要通过GC-MS进一步分析鉴定。

图6 处理前后的猪肉样品响应值PCA分析图

2.4HS-SPME-GC-MS的测定结果

采用HS-SPME-GC-MS方法检测出微生物脂肪酶Y3处理前后两种样品的挥发性化合物分别为54种和47种,主要为醛类、醇类、酮类和烃类等(表2),经微生物脂肪酶处理的猪肉样品,其醛类化合物、醇类化合物、芳香烃类化合物和酮类化合物的相对百分含量比原猪肉高,而这些挥发性成分与肉品风味形成密切相关,这与电子鼻检测结果一致。

2.4.1 醛类化合物 醛类是在熟猪肉的挥发性物质中被鉴定出来的主要成分,而肉类风味物质中的大部分醛类来自脂肪酸的氧化降解。从表2可以看出,微生物代谢产生的脂肪酶处理后的猪肉样品中检测出了9种醛类物质,百分含量为52.66%,己醛、壬醛、苯甲醛、正辛醛的百分含量均较高,其中己醛变化最明显。正辛醛、壬醛可能是酶促氧化的产物,正辛醛为生嫩的新香,而壬醛则为清香,Drumm[20]证实了正辛醛、壬醛是油酸氧化的产物;己醛主要来自ω-6不饱和脂肪酸,具有清香的青草香;苯甲醛具有令人愉快的水果香。由此可见,醛类化合物在改善猪肉风味中起着主要的作用。

2.4.2 醇类化合物 醇类化合物对肉味香气的形成不如醛类化合物影响显著,但在肉类风味的形成中也起关键的作用。醇类物质主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不饱和脂肪酸衍生而来的。如表2所示,脂肪酶处理前后猪肉样品中均检测出了醇类物质,百分含量分别为5.15%和18.71%。不饱和醇具有类似金属的气味,一般认为是由脂肪酸衍生或羰基化合物还原产生,对肉品的风味形成有一定的作用。经微生物脂肪酶处理后的猪肉样品中的正戊醇来自于亚油酸,而正己醇可能是由棕榈酸和油酸生成的。

2.4.3 酮类化合物 猪肉中的酮类化合物是由不饱和脂肪酸热氧化或降解以及氨基酸降解而产生的。酮类化合物的相对百分含量不如醛类化合物理想,对风味的贡献要小于醛类,但也有研究者指出,不同肉风味间的差异主要来自羰基化合物的定性定量差异。3-辛酮清香并有干酪味,其相对百分含量也很高,可见也可能是猪肉挥发性风味成分,所以酮类化合物对肉品风味的形成也极为重要。

2.4.4 其它化合物 含氮、含硫化合物是肉品中的重要呈味物质,其来源于氨基酸和还原糖之间的Maillard反应,氨基酸(如脯氨酸)的热解及硫胺素的热解,多数具有肉香味,其中二硫化碳经过酶处理减少有可能是随着检测温度升高使其挥发,导致含量减少。酯由肌肉组织中脂质氧化所产生的醇和游离脂肪酸之间的相互作用所产生,本实验检出的亚砷酸三(三甲基硅烷基)酯对猪肉风味也有影响。

表2 样品的挥发性化合物成分

续表

注:“-”表示未检出。

脂肪酶处理前后样品中检测出的各种烷烃物质对肉品风味影响不大,如检出的十二甲基环六硅氧烷、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷百分含量小但也对猪肉风味有影响,风味研究中认为它们是形成对肉的风味有贡献的杂环化合物的重要中间体,对形成肉香具有不可忽视的基底作用。

3 讨论

影响肉类风味的前体物质有很多种,主要由氨基酸、肽类、糖类、硫胺素、类脂和维生素等物质组成。鲜肉经过发酵成熟或热加工处理后,风味前体物降解产生大量滋味物质,呈现出肉类特有的鲜味,主要是因为肉在加热过程中会发生复杂的化学反应从而形成风味,这些反应包括脂质的热氧化、糖的降解、氨基酸与化合物间的反应以及各种反应之间的相互作用。在肉品风味形成的过程中,酶起到了至关重要的作用,主要为脂肪酶、蛋白酶等风味酶。脂肪酶参与脂肪的水解及氧化反应,水解产物能有效提高肉品原有的风味。但由于内源酶较为复杂,近来很多研究从外源酶着手,通过向肉制品中添加外源酶来加速脂肪的降解以促进风味的形成。Diaz等[21]发现添加外源性酶能够促进干发酵香肠产生芳香族化合物,提高香肠风味。Fernandez[8]等发现将胰脂酶添加到发酵香肠中,对风味的形成有促进作用,也可减少成熟时间。

然而,为了更好的满足肉品加工工业发展需求,寻求一种来源广泛、成本低廉的酶制剂是亟待解决的主要问题,是作为外源酶研究的主要对象。微生物脂肪酶具有易获得、生长速度快,发酵周期短、易于代谢调控等特点,是工业发酵生产的理想原料源泉。本课题筛选的产脂肪酶菌株Y3与其他产脂肪酶的菌株相比,具有产酶活力较高、温度稳定性好等特点,且代谢产物对酸有一定耐受性,属于酸性脂肪酶。将其发酵液添加到猪肉中,可以释放出大量特征脂肪酸,酶解后产生的醛类、醇类、酮类等挥发性物质成分含量有所增加,能有效提高猪肉原有的风味,对增强猪肉风味具有一定的作用,适于工业化发酵生产。

4 结论

土样经过富集培养、初筛、初始发酵培养基复筛分析后,得到一株产脂肪酶活力较高的菌株Y3,其产酶活力达到7.6 U/mL,结合菌株形态学特性和26S rDNA序列分析,最终鉴定为霉菌属的镰刀菌(Fusariumtricinctum)。电子鼻检测结果表明,经微生物代谢产生的脂肪酶处理后,猪肉样品中的挥发性风味物质在硫化物、有机硫化物、乙醇类、芳香类和含甲烷类等成分含量变化有明显区分;PCA分析方法能说明微生物脂肪酶酶解后产生的挥发性成分有效地提高了猪肉原有的风味。经GC-MS检测微生物脂肪酶处理的猪肉样品挥发性成分主要为醛类、醇类、酮类和芳香烃类等,其中醛类物质的相对百分含量变化较高(52.66%),其次分别为醇类(18.71%)、芳香烃类(10.98%)、酮类(8.27%)等,这与电子鼻检测结果一致,进一步表明了微生物脂肪酶对改善猪肉风味具有贡献作用。

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AnalysisoftheeffectofmicrobiallipaseonporkflavorbyelectronicnosecombinationHS-SPME-GC-MS

BAIXue,YANGShuang,MENGXin*

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

The volatile components of pork samples before and after lipase treatment were extracted by headspace solid phase microextraction(SPME),and analyzed by electronic nose and GC-MS. The results showed that the electronic nose could distinguish the changes of the volatile flavor components before and after lipase treatment. The main component analysis(PCA)further explained that the addition of microbial lipase could effectively improve the flavor of pork;GC-MS detected 47 kinds of volatile ingredients,mainly aldehydes,alcohols,ketones,aromatic hydrocarbons,etc.,and the synergistic effect of these flavors constitute the peculiar contribution of microbial lipase to pork flavor,consistent with the results of electronic nose test.

lipase;electronic nose;gas chromatography-mass spectrometry;volatile compounds

2017-05-16

白雪(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：1245450233@qq.com。

*

孟鑫(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：食品功能脂质开发，E-mail：woxing1981@163.com。

辽宁省自然科学基金资助(2015010642);横向课题(LYHX2013015)；辽宁医学院校长基金项目(Y2011B10)；食品学院教学项目；2014年国家大学生创新课题(201410160033)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)22-0246-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.048