响应面法优化薏米中β-谷甾醇的提取工艺

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(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)

响应面法优化薏米中β-谷甾醇的提取工艺

张冬阳,郭雪松*

(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)

目的:采用超声波辅助提取薏米中的β-谷甾醇,为其在功能性食品等加工利用方面提供参考。方法:以薏米为原料,磨碎成粉,以乙醇为提取溶剂,以液料比、超声温度、超声时间、乙醇浓度为单因素,以β-谷甾醇提取得率为指标,运用响应面法研究各因素及其交互作用对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响。结果:超声辅助法提取薏米中的β-谷甾醇最佳提取条件:液料比17.5∶1 mL/g、超声温度52 ℃、超声时间38 min。在此条件下,以95%乙醇为提取溶剂,β-谷甾醇平均提取得率为8.93 mg/g,接近模型中的预测值8.97 mg/g。结论:该方法操作简便,得率较高,具有实际意义。

薏米,β-谷甾醇,超声辅助提取,响应面法

薏米(CoixchinensisTod)又称薏苡仁、薏仁米、药玉米等,是常见的一种谷物[1]。其营养价值和药用价值很高,不仅含蛋白质、脂肪、碳水化合物以及各种微量元素,还含有β、γ型两种谷甾醇。β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇类成分之一,属于四环三帖类化合物,具有很好的生理活性和安全性,不仅可以降低饮食中胆固醇的吸收,而且还可以降低人体血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)的含量[2]。谷甾醇以结晶醇状态存在于植物的不皂化物质中,也是植物油脂中的一种主要不皂化物。最常见的植物甾醇包括谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇和豆甾醇等[3]。β-谷甾醇对人体具有较强的抗炎作用,能够抑制人体对胆固醇的吸收、合成等;用于预防治疗冠状动脉粥样硬化类的心脏病;是重要的甾体药物和维生素D3的生产原料[3]。

乌汗其木格[4]以裸燕麦麸皮为原料,采用溶剂结晶法从其非皂化物中提取β-谷甾醇,测得粗提物中β-谷甾醇含量为2.02%。陈如寿[5]运用超声波法提取毛竹笋头中的β-谷甾醇,此方法提取率高于溶剂法以及超临界流体萃取法,并且耗费低,测得β-谷甾醇提取含量为0.249%。目前对薏米的研究报道多集中于对薏米的蛋白质、淀粉、多糖等的提取[6-7],有关薏米中谷甾醇提取及含量的测定,尚未见相关报道。对于β-谷甾醇的提取,大多是从燕麦、荞麦、竹笋、油脂等原料中提取[8-11],但是提取率相对较低。据文献[6]得知,薏米中每100 g总甾醇含有38.42 mgβ-谷甾醇,其含量位于前列,仅次于荞麦、燕麦中谷甾醇的含量。所以本实验通过响应面法优化薏米中β-谷甾醇的超声提取条件,并通过高效液相色谱法测定其含量,为其在食品、饲料等研究领域提供技术支持。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

薏米 自锦州市新玛特超市,粉碎过60目筛;β-谷甾醇标准品 纯度≥98%,北京索莱宝科技有限公司;甲醇、乙腈 色谱纯,郑州鑫瑞化验设备科技销售公司;水 超纯水;乙醇等其他试剂 均为分析纯,天津贝斯医药科技有限公司。

高速万能粉碎机 津市泰斯特仪器有限公司;LC-15C型高效液相色谱仪 岛津企业管理(中国)有限公司;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;电热恒温水浴锅 天津市秦斯特仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1β-谷甾醇提取工艺流程 薏米粉碎→70 ℃烘干→称取2 g粉末→加40 mL 95%乙醇→超声提取2 h→过滤提取液→旋转蒸发挥干溶剂→粗提物[12-14]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 液料比对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 称取5份薏米粉末各2 g,在超声时间为30 min,超声温度为45 ℃,乙醇浓度为95%的条件下,设定液料比分别为10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1 mL/g,研究液料比对β-谷甾醇提取得率的影响。

1.2.2.2 超声时间对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 称取5份薏米粉末各2 g,在液料比为15∶1 mL/g,超声温度为45 ℃,乙醇浓度为95%的条件下,设定超声时间分别为20、30、40、50、60 min,研究超声时间对β-谷甾醇提取得率的影响。

1.2.2.3 超声温度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 称取5份薏米粉末各2 g,在液料比为15∶1 mL/g,超声时间为30 min,乙醇浓度为95%的条件下,设定超声温度分别为15、30、45、60、75 ℃,研究超声温度对β-谷甾醇提取得率的影响。

1.2.2.4 乙醇浓度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 称取5份薏米粉末各2 g,在液料比为15∶1 mL/g,超声时间为30 min,超声温度为45 ℃的条件下,设定乙醇浓度分别为75%、80%、85%、90%、95%,研究乙醇浓度对β-谷甾醇提取得率的影响。

1.2.3 响应面实验 结合单因素实验结果,影响薏米中β-谷甾醇提取的显著因素为液料比、超声时间、超声温度,根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法,得出薏米中β-谷甾醇的最佳提取工艺条件,实验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken设计实验因素与水平

1.2.4β-谷甾醇含量的测定

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-乙腈(35∶65)；波长:246 nm；柱温:30 ℃；进样量:10 μL；流速:0.8 mL/min。

1.2.4.2 标准曲线的绘制 精确称取20 mgβ-谷甾醇标准品,用色谱甲醇定容至10 mL容量瓶中,配成浓度为2 mg/mL的标准品溶液,超声溶解后备用。取上述标准品溶液,制成浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL的溶液,依次进入高效液相色谱仪,以质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到标准曲线的线性回归方程为Y：=9097.9x+381.54,线性系数为0.9992,线性关系良好。

1.2.4.3 样品中β-谷甾醇含量的测定 粗提物用色谱甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶,0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。

β-谷甾醇提取得率(mg/g)=[β-谷甾醇浓度(mg/mL)×体积(mL)]/原料质量(g)

式(1)

1.2.5 数据分析 实验平行数3次,结果采用平均值±标准差形式表示,单因素实验采用SPSS 13.0软件和Excel软件进行数据处理。响应面实验采用Design Expert 8.0.6进行实验数据处理。

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 液料比对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 图1表明,随着液料比逐渐增大,β-谷甾醇提取得率呈现先增大后下降的趋势。在液料比为15∶1 mL/g时,β-谷甾醇提取得率最大。由于溶剂达到一定量时,即使增大溶剂量对提取得率影响也不大[15-16],因此为了节约溶剂,本实验选择液料比为15∶1 mL/g。

图1 液料比对薏米中β-谷甾醇提取率的影响

2.1.2 超声时间对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 图2表明,随着超声时间的增加,β-谷甾醇提取得率呈现先上升后下降的趋势,超声时间为30 min时,提取得率最高。当时间超过30 min时,提取得率逐渐下降,可能是由于时间过长,样品中β-谷甾醇部分被氧化分解,从而导致β-谷甾醇的提取得率呈现下降趋势,不利于植物甾醇的提取[17-19],因此选择超声时间为30 min。

图2 超声时间对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响

2.1.3 超声温度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 图3表明,随着超声温度的升高,β-谷甾醇提取得率先增大后减小,在15～45 ℃时β-谷甾醇提取得率逐渐升高,这是因为随着温度的升高,β-谷甾醇溶解度增大[19-21]。在45～75 ℃,由于温度升高,分子内部结构被破坏,β-谷甾醇的性质会有一些变化,发生氧化,导致提取得率下降[19]。因此,最适温度为45 ℃。

图3 超声温度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响

2.1.4 乙醇浓度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响 图4表明,随着乙醇浓度的增大,β-谷甾醇提取得率也随之增大。当乙醇浓度为95%时,β-谷甾醇提取得率有最大值。这是因为少量水的存在有助于提高植物甾醇的提取得率[22],因此选择最佳的乙醇浓度为95%。

图4 乙醇浓度对薏米中β-谷甾醇提取得率的影响

2.2响应面优化实验

2.2.1 实验设计及结果 根据单因素实验结果,选择液料比、超声时间、超声温度为考察因素,以β-谷甾醇提取得率为响应值进行优化,得到的响应面实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 利用Design Expert软件对实验数据进行回归拟合,得到β-谷甾醇提取得率分别与三因素之间二次多项回归模型的方程为Y=7.30+1.63A+1.33B+1.44C+0.19AB+0.45AC-0.34BC-0.89A2-0.81B2-1.27C2

对模型进行方差分析(见表3),方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度[22-23]。由表3可知,模型的p<0.0001,说明回归方程极显著,失拟项p=0.2119>0.05(不显著),说明回归方程与实际情况有较好的吻合,实验误差小。该回归方程的拟合度是99.18%(R2=0.9918),说明实际值与预测值拟合较好,实验方法可行。一次项A、B、C对y值的影响极显著(p<0.0001),交互项AC、BC对y值影响显著(p<0.05),二次项A2、B2、C2对y值影响极显著(p<0.01)。根据F值的大小,得出这三个因素对β-谷甾醇提取得率的影响为:A>C>B。

表3 方差分析结果

注:**为极显著,p≤0.01;*为显著,p≤0.05;不标记为不显著,p>0.05。

2.2.3 交互作用 图5表示液料比和提取时间交互作用对β-谷甾醇提取得率的影响,响应曲面坡度比较平滑,说明其交互作用较小[23-24]。随着两因素的变化,提取率平缓上升,交互作用较弱,这与方差分析结果一致。从响应曲面图中可以看出液料比在15.5∶1～17.5∶1 mL/g之间,提取时间在30～40 min之间,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

图5 提取时间与料液比交互作用图

图6表示提取温度和液料比交互作用对β-谷甾醇提取得率的影响,由响应面曲线图可知,曲面较为陡峭,说明两因素交互作用较显著[25-26]。随着提取温度及液料比的增大,提取率先增大后趋于稳定,上升的幅度较小。当超声温度在48～54 ℃,液料比在16.5∶1～17.5∶1 mL/g时,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

图6 提取温度与液料比交互作用图

图7表示提取温度和提取时间交互作用对β-谷甾醇提取得率的影响,根据响应面图弯曲程度可知,曲面较为陡峭,说明两因素交互作用显著。随着两因素的增加,提取得率先增大后下降。当提取温度在48～54 ℃,提取时间在30～40 min之间,β-谷甾醇提取得率达到最大值。

图7 提取温度与提取时间交互作用图

2.2.4 验证实验 应用Box-Behnken软件得到的最佳工艺:即液料比17.52∶1 mL/g,超声温度51.63 ℃,超声时间38.24 min,由于工艺的需要，将液料比的结果保留一位小数，其他条件取整，修正为：液料比17.5∶1 mL/g,超声温度52 ℃,超声时间38 min,此条件下得到β-谷甾醇提取得率的模型预测值为8.97 mg/g。为验证模型预测值的可靠性,在此条件下进行3次平行实验,得到β-谷甾醇提取得率平均值为(8.93±0.03) mg/g,与预测值8.97 mg/g比较接近,说明该模型回归方程具有可靠性,可以应用于β-谷甾醇提取得率的工艺研究。

3 结论

通过单因素实验分析,选择对薏米中β-谷甾醇提取得率影响较大的三个因素,并应用Design-Expert.V 8.0.6软件中的Box-Behnken设计方法,得出β-谷甾醇提取的最佳工艺条件:液料比17.5∶1 mL/g,超声温度52 ℃,超声时间38 min,此条件下,以95%乙醇为提取溶剂,得到β-谷甾醇的提取得率为8.93 mg/g,与预测值8.97 mg/g基本吻合,说明该方法得到的薏米中β-谷甾醇的提取条件真实可靠,并且提取得率较高。因此本条件可以成为β-谷甾醇提取的可靠的方法。

[1]曹向宇,刘剑利,芦秀丽,等.薏米蛋白提取方法比较研究[J].食品科学,2011(8):88-92.

[2]董红艳,张守文.薏米蛋白的酶水解工艺优化[J].农产品加工·学刊,2013(5):46-50.

[3]钱伟. 甾醇和必需脂肪酸微囊化研究[D].大连:大连工业大学,2009.

[4]乌汉其木格,张美莉. 裸燕麦麸皮中β-谷甾醇的提取[J]. 食品与发酵工业,2007(1):131-133.

[5]董红艳,张守文. 薏米蛋白的酶水解工艺优化[J]. 农产品加工·学刊,2013(5):46-50.

[6]熊柳,韩忠杰,孙庆杰. 薏米粉及其淀粉的理化性质和淀粉消化性对比[J]. 中国粮油学报,2012(7):32-37.

[7]庄玮婧. 薏米多糖结构与理化性质的研究[D].福州:福建农林大学,2008.

[8]陈如寿,殷钟意,郑旭煦，等.响应面法优化竹笋剩余物甾醇的超声辅助提取工艺[J].食品科学,2012(14):85-90.

[9]洪庆慈,王梅,姜伟,等.燕麦中主要甾醇的鉴定和效能实验[J].食品科学,2002(1):103-106.

[10]李和,李玉帼.植物油中常见的几种植物甾醇的薄层色谱分离与鉴别[J].中国油脂,1997(2):20-22.

[11]邱丰艳,丁力,曹红云.高效液相色谱法测定油脂中β-谷甾醇的含量[J].中国油脂,2014(7):91-95.

[12]蔡森森.桑白皮甾醇的提取及功能研究[D].吉林:吉林大学,2013.

[13]杨丰滇.传统山药和无硫山药β-谷甾醇、腺苷、亚油酸含量研究[D].郑州:河南中医学院,2014.

[14]Yongqian,Zhang Zhihui,Xu Chao,et al. Development and Validation of a HPLC Method for Determination of Flavone Glycoside-Camellianin B in Cephalotaxus Sinensis[J]. Journal of Beijing Institute of Technology,2017(1):129-134.

[15]支文星,程玉钏,李先荣.HPLC法测定白土茯苓中β-谷甾醇的含量[J].中国中医药信息杂志,2010(4):49-50.

[16]Araceli Olivares,Irene Martínez,Andrés Illanes.Enzyme assisted fractionation of wood sterols mixture by short path distillation[J]. Chemical Engineering Journal,2012(191):557-562.

[17]Guihua Xu,Lei Guan,Junliang Sun,et al.Oxidation of Cholesterol andβ-Sitosterol and Prevention by Natural Antioxidants[J]. Journal of Agriculture,2009,57(19):9284-9292.

[18]项昭保,刘星宇.响应面法优化超声-微波协同辅助提取橄榄多酚工艺研究[J].食品工业科技,2016(1):195-200.

[19]昌超. 茶叶籽中植物甾醇的提取及其降血脂功能评价[D].长沙:湖南农业大学,2015.

[20]徐艳阳,蔡森森,宋艳翎,等.响应面法优化桑白皮甾醇微波辅助提取工艺[J].食品科学,2013(18):65-69.

[21]林丽静,吕国提,李积华,等.响应面法优化毛竹笋笋头中β-谷甾醇提取工艺的研究[J].食品工业科技,2012(22):269-271,275.

[22]高政.菜籽植物甾醇的提取、纯化及抗氧化活性研究[D].武汉:华中农业大学,2009.

[23]李阳,池建伟,张虹,等.HPLC法测定油脂混合体系中β-谷甾醇添加量的研究[J].福州大学学报：自然科学版,2014(1):143-148.

[24]Sarangthem K,Singh T N,Thongam W.Transformation of fermented bamboo(Dendrocalamushamiltonii)shoots into phytosterols by microorganisms[J]. Journal of Food Science and Technology Mysore,2003(40):622-625.

[25]陈博,耿丽晶,黄鹤,等. 响应面法优化速食海鲜羹的加工工艺[J]. 食品工业科技,2017(4):1-13.

[26]LC Gutkoski,AA El-Dash. Effect of extrusion process variables on physical and chemical properties of extruded oat products[J]. Plant Foods for Human Nutrition,1999(4):315-325.

Optimizationofextractiontechnologyofβ-sitosterolfromcoixseedbyresponsesurfacemethodology

ZHANGDong-yang,GUOXue-song*

(School of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

Objective:Extraction ofβ-sitosterol from coix seed by ultrasound,and use to provide a reference for processing and utilization of functional food. Methods:In this experiment,coix seed was used as raw material and ground into powder,and the ratio of material to liquid,ultrasonic temperature,ultrasonic time and ethanol concentration were taken as single factor. The response surface method was used to study on the effects of different factors and their interactions onβ-sitosterol extraction rate in coix seed. Results:The optimal extraction conditions ofβ-sitosterol in coix seed were as follows:liquid ratio(methanol:coix seed)was 17.5∶1 mL/g,ultrasonic temperature was 52 ℃,ultrasonic time was 38 min. Under these conditions,theβ-sitosterol average extraction rate was 8.93 mg/g close to the predicted value 8.97 mg/g in the model. Conclusion:The method had the advantages of simple operation,high yield and practical significance.

coix seed;β-sitosterol;ultrasonic assisted extraction;response surface method

2017-04-25

张冬阳(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程，E-mail：zdy201520027@163.com。

*

郭雪松(1970-)，男，硕士，副教授，研究方向：农产品精深加工及综合利用，E-mail：356365279@qq.com。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.040