超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速测定白酒中5种天然甜味物质

2017-12-06赵振宇汪地强

中国酿造 2017年11期

关键词：甜味液相质谱

赵振宇,刘松,江锋,汪地强*

(贵州茅台酒股份有限公司,贵州仁怀 564501)

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速测定白酒中5种天然甜味物质

赵振宇,刘松,江锋,汪地强*

(贵州茅台酒股份有限公司,贵州仁怀 564501)

建立利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q/Orbitrap MS)快速测定白酒中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖等5种天然甜味物质的分析方法。样品经蒸馏水稀释一定倍数后,过0.22 μm微孔滤膜,直接进样分析检测。以Polaris NH2色谱柱为分析柱,乙腈-5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液为流动相进行梯度洗脱分离,在电喷雾电离源负离子模式下进行检测。结果表明,5种天然甜味物质在0.2～100.0 mg/L的范围内线性关系良好(相关系数R＞0.996),基质加标回收率范围为86.9%～105.4%,相对标准偏差(RSD)为0.5%～10.8%,检出限为0.05～0.12 mg/L。该方法前处理简单,测定快速、准确、灵敏度高,非常适合白酒中这5种天然甜味物质的快速筛查和定量分析。

白酒;超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱;天然甜味物质;快速测定

白酒大曲、酒醅在发酵过程中,原料淀粉被微生物分解为葡萄糖等糖类[1-2],在蒸馏过程中,部分糖类可能因共沸等原因带入白酒中成为重要的风味物质,周雅璇等[3-4]发现白酒中有微量的葡萄糖,但未见有关其他糖类的研究报道。白酒中糖类物质能够增强白酒的柔和度、掩盖白酒中的不愉悦味道,但部分不良白酒生产企业利用糖类物质在白酒中的作用,达到以次充好的目的,在白酒中违规添加甜味物质[5]。

白酒中甜味物质的研究主要集中在人工合成甜味剂上[6-8],近些年国家食品药品监督管理总局发布的酒类监督抽检不合格产品信息中,违规使用人工甜味剂是最常见不合格项之一,但是对甜度较低的糖类物质的监管处于空白,且目前白酒中有关单、双糖的研究在国内未见报道。本研究在高效液相色谱及液质联用法测定单、双糖的基础上[9-14],采用高分辨质谱,以期建立一种能同时、快速、准确测定白酒中痕量葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

白酒:市售;乙腈(色谱级):美国化学学会;乙酸铵(色谱级)、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖(标准品):美国Sigma公司;所有实验用水都为超纯水。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole/elec-trostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,UPLC-Q/OrbitrapMS)联用仪:美国ThermoFisherScientific公司;默克Milli-Q Advantage A10超纯水系统:美国MilliporeMilli-Q公司;N-EVAP-24氮吹仪:美国OA-SYS公司;AllegraX-22系列多功能台式高速离心机:美国贝克曼公司;ME104E分析天平:梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

移取0.1mL酒样至5.0mL离心管中,加水定容至2.0mL,漩涡振荡5 min后,在4℃、10 000 r/min条件下离心5 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜后进样分析。

1.3.2 色谱条件

进样体积5.0μL;色谱柱:PolarisNH2(2.1mm×150mm,3.5 μm);柱温:30 ℃;流动相:乙腈-5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液;流速0.3 mL/min;线性梯度洗脱,洗脱程序见表1,整个分析流程17 min。

表1 线性洗脱程序Table 1 Linear elution program

1.3.3 质谱条件

质谱条件:离子源采用加热电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI);吹扫气:45 arb;鞘气:15 arb;反吹气:0 arb;电离电压:-3.0 kV;离子传输管温度:350℃;离子源温度:240℃;负离子模式监测,采用full MS-TargetMS2扫描方式测定,扫描范围50～370m/z,fullMS扫描的分辨率为70000,Target MS2扫描模式分辨率为17 500。

1.3.4 标准溶液配制

葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖分别准确称取0.1000g至100.0 mL容量瓶中,用超纯水定容至100.0 mL,得到质量浓度为1.0g/L的标准储备液,分别精密量取上述5种标准储备溶液适量,置10.0 mL容量瓶中,加水定容,配制成质量浓度为0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L的混合标准品工作液。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的优化

5种天然甜味物质中,葡萄糖与果糖,蔗糖、麦芽糖与乳糖分别是同分异构的单糖和双糖,分子质量完全一样,结构相似,它们的二级特征碎片也有极高的相似度,因此用质谱分别检测5种天然甜味物质含量的前提是实现其在液相部分的完全分离[15]。实验中考察了乙腈-乙酸铵溶液体系和甲醇-乙酸铵溶液体系的流动相,发现在甲醇-乙酸铵溶液体系中,5种化合物不能完全分离,而乙腈-乙酸铵溶液体系能较好的将5种化合物洗脱分离。同时发现为乙腈起始浓度低于75%时,果糖与葡萄糖无法分离,当乙腈起始浓度高于85%时,5种化合物的分离时间延长,且蔗糖、麦芽糖、乳糖的响应较差。

2.2 质谱条件的优化

利用流动注射的方式对5种化合物进样分析,优化离子源电压、温度、鞘气、辅助气、吹扫气、脱溶剂温度等参数,得到5种化合物的母离子均为分子离子峰[M-H]-,5种化合物的总离子流色谱图见图1,各物质的特征离子、碰撞能量见表2。

图1 5种天然甜味物质质谱图Fig.1 Mass spectrum of 5 natural sweeteners

表2 5种天然甜味物质离子对及碰撞能量Table 2 Ion pairs and collision energy of 5 natural sweeteners

2.3 样品前处理

考虑到乙醇对5种化合物检测结果的影响,采取3种样品前处理方式进行比较。用水将样品稀释到酒精度10%vol后过0.22μm滤膜后进样分析;酒样加热氮吹除醇后0.22μm滤膜后进样分析;酒样稀释至酒精度＜5%vol后过0.22 μm滤膜后进样分析。3种方法对比发现,乙醇对5种天然甜味物质的回收率及其峰型有严重的影响。向仲朝[15]也得出过同样的结论,在酒精度10%vol时,样品的回收率较差,低浓度加标样品回收率＜72.1%,高浓度加标样品回收率＞140.5%,而在酒精度＜5%vol时,检测结果较为满意。采用加热氮吹除醇处理的方法的稳定性较差,在10.0 mg/L加标水平上,回收率可以达到184.1%,而在100.0 mg/L加标水平上,回收率仅为44.1%。故最终选择酒样稀释至酒精度＜5%vol的方法。

2.4 标准曲线及方法检出限

将浓度范围为0.2～100.0 mg/L系列的混合标准工作液,分别在Q-Exactive仪器上进行测定,以峰面积为Y轴,质量浓度为X轴,得到线性回归方程。对空白样品进行加标实验,根据检出限为基线噪音的10倍的方法测定方法检出限,结果见表3。

表3 五种天然甜味物质的线性方程、相关系数和检出限Table 3 Linear equations,correlation coefficients and detection limit of 5 natural sweeteners

2.5 加标回收率试验

在上述实验条件下,对样品进行加标回收试验,加标质量浓度分别为10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L,结果见表4。

表4 五种化合物的加标回收率试验结果Table 4 Recovery rates tests results of 5 natural sweeteners

由表4可知,果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的平均回收率分别为86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相对标准偏差(relative standarddeviation,RSD)分别为1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%,表明该方法准确度较好。

2.6 市售白酒样品的测定

选择市售的10款白酒样品(编号A～J,包含固态法白酒和液态法白酒),按照1.3部分的方法制备样品待测液,在仪器上检测,每种样品取2份平行测试,样品中5种天然甜味物质的含量见表5。

表5 市售白酒中五种天然甜味物质的含量Table 5 Contents of 5 natural sweeteners in commercialBaijiu

由表5可知,无论是固态法白酒还是液态法白酒,均有痕量的天然甜味物质检出,周雅璇等[3-4]同样发现白酒中有葡萄糖存在,可能是酿酒原料在发酵过程中产生了天然甜味物质,在白酒蒸馏过程中共沸带出进入白酒中。但是表5中部分白酒中有大量的天然甜味物质检出,有人为添加的嫌疑,需进一步对同类酒样进行筛查后确定。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Q/Orbitrap MS)同时检测白酒中5种痕量甜味物质的方法。样品经过稀释定容,高速冷冻离心后过滤处理,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液为流动相梯度洗脱,采用Polaris NH2色谱柱分离,在负离子监测模式下进入高分辨质谱进行分析。结果表明,果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖在0.2～100 mg/L质量浓度范围内,线性关系良好,R2＞0.996,平均回收率分别为86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相对标准偏差(RSD)分别为1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%。本方法系首次运用高分辨质谱检测白酒中的天然甜味物质,具有专属性强、前处理简单、准确可靠、灵敏度高、重复性好等优点。

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