尖锐湿疣患者外周血Treg/Th17细胞平衡及相关转录因子的表达

陈 华，熊 琦，陈永艳

(1 遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563000； 2 重庆市綦江区人民医院，重庆 綦江 401420)

·论著·

尖锐湿疣患者外周血Treg/Th17细胞平衡及相关转录因子的表达

陈 华1,2，熊 琦1，陈永艳1

(1 遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563000； 2 重庆市綦江区人民医院，重庆 綦江 401420)

目的探讨Treg/Th17细胞失衡在尖锐湿疣(CA)发病及复发机制中的作用及意义。方法选取52例CA患者(初发27例，复发25例)作为研究组，30例健康者为正常对照组，采用流式细胞术(FCM)检测其外周血Treg、Th17细胞的比例，实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA和RORγt mRNA的表达水平。结果CA患者外周血Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达水平高于正常对照组，复发组高于初发组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；Th17细胞比例、RORγt mRNA表达水平低于正常对照组，复发组Th17细胞比例低于初发组，差异有统计学意义(均P<0.05)；Treg/Th17比值高于正常对照组[4.60(3.20,8.68) vs 1.39(1.05，2.05)]，复发组高于初发组[8.19(4.21,10.81) vs 3.52(2.47，4.85)]，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论CA患者存在Treg/Th17细胞失衡，复发患者Treg/Th17细胞失衡更显著，并可能在CA发病及复发机制中起重要作用。

尖锐湿疣； Foxp3； RORγt； Treg； Th17； Treg/Th17

尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染所致的性传播疾病，传染性强、复发率高[1-2]，目前发病及复发机制尚不完全清楚。有资料[3-4]表明，CA的发生、迁延不愈、顽固难治及多次复发与机体的细胞免疫功能低下有关。既往研究[5-6]表明，CA患者存在Th1/Th2失衡，导致机体不能完全清除HPV，是促进CA多次复发的重要因素之一。但Th1/Th2失衡不能完全阐明CA的免疫发病机制，推测CD4+T细胞中存在一些新的细胞亚群也可能与CA的发病有关。近年来，随着对调节性T细胞(regulatory cell,Treg)、辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)两类新的CD4+T细胞的深入研究，有文献报道Treg/Th17细胞平衡的异常在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的发生、发展中起重要作用[7-8]。CA患者是否也存在Treg/Th17细胞平衡的偏移，目前研究较少。本研究通过检测初发和复发CA患者外周血Treg和Th17细胞的比例，相关转录因子Foxp3和RORγt mRNA的表达水平，探讨Treg/Th17细胞失衡在CA发病及复发机制中的作用及意义，为CA的免疫治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015年11月—2016年6月在本院皮肤性病门诊就诊，符合CA诊断标准患者52例[9]，男性30例，女性22例，年龄15～74岁，平均年龄(33.9±13.5)岁，进一步分为初发组和复发组。CA初发组27例：首次就诊并符合CA诊断者，均未经过治疗，男性17例，女性10例，平均年龄(36.3±14.5)岁；CA复发组25例：既往诊断CA，经治疗后3个月内复查，在原发皮损处或邻近部位出现新发疣体者，男性13例， 女性12例，平均年龄(31.4±12.1)岁。排除标准：患有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、严重的系统性疾病、感染性疾病及1个月内使用过免疫调节剂、免疫抑制剂及抗菌药物的患者，以及妊娠妇女。选择同期本院的健康体检者30例作为对照组，其中男性17例，女性13例，平均年龄(30.6±8.7)岁，各组的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究遵循伦理学标准，所有受试者均在知情同意的情况下留取标本。

1.3 实验方法

1.3.2 实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR) 检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Foxp3、RORγt mRNA的表达水平：抽取外周静脉血5 mL，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。Trizol一步法提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。按照试剂盒说明书合成cDNA操作，并以此模板进行Real-time PCR扩增。Real-time PCR特异性引物均由宝生物工程(大连)有限公司设计并合成。内参基因β-actin上游：5′-ACAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游：5′-CATGCCGGAGCCGTTGTCGAC-3′，扩增产物片段长度101 bp；目的基因Foxp3上游：5′-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3′，下游：5′-TCTCTCTGCCTCAGCCTTGCC-3′，扩增产物片段长度184 bp。目的基因RORγt上游：5′-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′，下游：5′-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3′，扩增产物片段长度184 bp。逆转录反应条件：37℃ 15 min；85℃ 5 s，完成cDNA合成。RT-PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性 5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。循环结束后应用系统软件绘制扩增曲线、熔解曲线。用2-△△Ct法计算相对表达量，ΔCt=Ct(目的)-Ct(内参)。

2 结果

2.1 外周血Treg、Th17细胞的比例 CA组患者外周血Treg细胞比例高于正常对照组，Th17细胞比例低于正常对照组，Treg/Th17细胞比值高于正常对照组，差异均有统计学意义(t=-7.38,P<0.001;t=3.383,P=0.001;Z=-5.425,P<0.001)。CA 患者不同组比较：CA复发组Treg细胞比例高于CA初发组，Th17细胞比例低CA初发组，Treg/Th17细胞比值高于CA初发组，差异均有统计学意义(t=-3.294,P=0.002;t=2.726,P=0.009;Z=-3.086,P=0.002)。见表1，图1、2。

表1CA组和对照组外周血Treg、Th17细胞比例的检测结果

Table1Proportion of Treg cells and Th17 cells in peripheral blood of CA group and control group

组别例数Treg(%)Th17(%)Treg/th17CA组524．74±1．47a1．06±0．63a4．60(3．20，8．68)a CA初发组274．14±1．081．27±0．703．52(2．47，4．85) CA复发组255．38±1．59b0．82±0．46b8．19(4．21，10．81)b对照组302．52±0．971．57±0．711．39(1．05，2．05)

A：与正常组比较P<0.05; b：与CA初发组比较，P<0.05

图1 各组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例

图2 各组CD3+CD8-IL17+Th17细胞的比例

2.2 Foxp3 mRNA、RORγt mRNA的表达水平 CA患者外周血PBMC中Foxp3 mRNA表达水平高于对照组，RORγt mRNA表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(Z值分别为-5.122、-4.188,均P<0.001)。CA患者不同组比较：CA复发组Foxp3 mRNA表达水平高于CA初发组，差异有统计学意义(t=-3.236,P=0.003)，RORγt mRNA表达水平与CA初发组比较差异无统计学意义(Z=-1.713,P=0.087)。见表2。内参基因和目的基因实时荧光定量PCR见图3～5。

表2CA组和对照组外周血Foxp3和RORγt mRNA的表达水平

Table2Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in peripheral blood of CA group and control group

组别例数Foxp3mRNARORγtmRNACA组523．09(1．46，6．75)a0．36(0．23，0．63)a CA初发组273．74±3．580．34(0．23，0．72) CA复发组258．70±6．84b0．37(0．25，0．59)对照组301．20(0．44，1．63)0．93(0．68，1．62)

A：与正常组比较P<0.05; b：与CA初发组比较，P<0.05

A: 扩增曲线;B:熔解曲线；C: 熔解峰图

A: 扩增曲线;B:熔解曲线；C: 熔解峰图

A: 扩增曲线;B:熔解曲线；C: 熔解峰图

3 讨论

CA患者存在局部和全身细胞免疫异常，包括T细胞、NK细胞(自然杀伤细胞)的异常以及细胞因子失衡等[10]，且随着病情的反复及病程延长，细胞免疫功能降低更明显[3]，说明细胞免疫功能抑制在CA的发病及复发中扮演重要的角色。

Treg细胞是CD4+T 细胞的新亚群，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用，在一些病毒感染性疾病中 Tregs起着非常重要的平衡作用，一方面可以抑制过度免疫反应造成的组织损伤,另一方面还可抑制宿主对某些病原体感染时发挥有效的保护性免疫反应，不利于宿主对病原体的清除。Foxp3是目前公认的 Tregs 最特异的分子标记，也是其生长发育和发挥抑制功能的关键[11]。本研究结果显示，CA患者外周血Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达水平较对照组高，复发患者高于初发患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，与文献[12-13]研究结果一致。笔者推测 HPV感染可诱导Treg细胞活化和增殖，抑制宿主对HPV的特异性细胞免疫反应，不利于宿主对HPV的清除，导致了HPV的持续感染。

Th17细胞是近年来发现的一种CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等炎性细胞因子，促进中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎症反应，在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的病理过程中发挥重要作用[14]。RORγt是维甲酸相关孤儿核受体家族成员之一，在IL-6与TGF-β协同作用下，可诱导Th17细胞生成，是Th17细胞特异性的转录因子。本研究结果显示，CA患者外周血Th17 细胞比例、RORγt mRNA表达水平低于正常对照组，复发患者Th17 细胞比例低于CA初发患者，差异具有统计学意义(均P<0.05)，与孙广政[15]的研究结果一致，但与翁智胜等[16]的研究不同。笔者推测CA患者Th17细胞比例及RORγt mRNA表达水平降低，使机体抑制HPV病毒复制的能力下降，导致机体出现免疫抑制，不能有效清除HPV病毒。尽管目前研究结果不一致，但都认为Th17 细胞可能与CA的发生、发展及复发有关，但具体机制尚有待进一步研究。

Treg细胞与 Th17细胞之间存在复杂的相关性，分化上密切关联，功能上相互拮抗，生理情况下Treg细胞与 Th17细胞处于平衡状态，维持机体免疫功能的平衡与稳定，TGF-β和IL-6在这一平衡中起到关键的作用。当感染存在时，TGF-β联合IL-6共同促进Th17细胞分化；感染清除后，IL-6表达下降，TGF-β可促进Treg细胞的分化。本研究结果还显示，CA患者外周血Treg/Th17细胞比值高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明CA患者外周血存在Treg/Th17细胞失衡，其平衡向Treg细胞方向偏移。Treg细胞比例升高，导致机体免疫抑制和免疫无能，同时抑制Th1和Th2分化，从而负向调节Th1和Th2介导的细胞毒性T细胞活化、免疫应答及炎症反应；Th17细胞降低，会减弱机体对炎症因子和趋化因子级联反应等，从而导致HPV病毒持续感染。进一步分析发现，CA复发患者Treg/Th17比值高于CA初发患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示CA复发患者Treg/Th17平衡紊乱更显著，表明Treg/Th17细胞平衡紊乱与CA复发有关，并可能在CA复发机制中起重要作用。

综上所述， CA患者存在Treg/Th17细胞失衡，复发患者Treg/Th17细胞失衡更显著，Treg/Th17细胞失衡在CA发病及复发机制中可能起重要作用，临床上可通过恢复Treg/Th17细胞之间平衡，促进HPV病毒的清除，减少CA的复发。本实验结果对传统的 CA 患者Th1/Th2 失衡理论进行了补充，但Th17、Treg与Th1、Th2细胞之间如何进行调节以及与感染HPV亚型的相关性还有待进一步的研究。

[1] 梁齐飞, 王晓, 汤希凡, 等. 尖锐湿疣亚临床感染转归与局部T淋巴细胞亚群检测[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2016, 30(1): 44-46.

[2] Rositch AF, Koshiol J, Hudgens MG, et al. Patterns of persistent genital human papillomavirus infection among women worldwide: a literature review and meta-analysis[J]. Int J Cancer, 2013, 133(6): 1271-1285.

[3] 曹嘉力, 何焱玲, 张秀英. 尖锐湿疣患者HPV感染与细胞免疫功能的相关性[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2012, 26(5): 383-385.

[4] Shi YJ, Yang J, Yang W. Mechanistic investigation of immunosuppression in patients with condyloma acuminata[J]. Mol Med Rep, 2013, 8(2): 480-486.

[5] 陈金兰, 许仕军. 超脉冲CO2激光联合胸腺肽治疗尖锐湿疣的疗效及机制分析[J]. 中国性科学, 2015, 24(7): 55-58.

[6] 涂权梅, 吕杰强, 陈小鸣, 等. 复发与未复发女性尖锐湿疣患者Th1/Th2细胞因子检测[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2009, 23(8): 498-499.

[7] Zhao J, Ma J, Zhang X, et al. Equilibrium of Treg/Th17 cells of peripheral blood in syphilitic patients with sero-resistance[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(6): 2300-2304.

[8] Geng X, Xue J. Expression of Treg/Th17 cells as well as related cytokines in patients with inflammatory bowel disease[J]. Pak J Med Sci, 2016, 32(5): 1164-1168.

[9] 中华人民共和国卫生行业标准. 尖锐湿疣诊断标准及处理原则：WS 235-2003 [S]. 北京，2003：1-6.

[10] 任荣鑫, 郑和义. 尖锐湿疣局部免疫功能抑制及其机制的研究进展[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2014, 28(2): 200-201,204.

[11] Haque R, Lei F, Xiong X, et al. The regulation of Foxp3-expressing regulatory T cells[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2011, 11(4): 334-346．

[12] 王剑磊, 王琪, 徐宏俊, 等. 尖锐湿疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测及其与HPV亚型的相关性[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2014, 28(6): 560-562,566.

[13] 张慧, 王丽. 尖锐湿疣患者外周血辅助性T细胞17/调节性T细胞的检测及其临床意义[J]. 中国药物与临床, 2013, 13(1): 43-44.

[14] 戴超, 李向培. 系统性红斑狼疮Th17细胞分子调控机制研究进展[J]. 安徽医药, 2016, 20(5): 817-820.

[15] 孙广政. 尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒感染与调节性T淋巴细胞和辅助性T细胞17的关系[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2013, 7(9): 4069-4071.

[16] 翁智胜, 李晓辉, 彭洁雯, 等. 尖锐湿疣患者外周血中Th17细胞及IL-17的检测[J]. 皮肤性病诊疗学杂志, 2013, 20(5): 327-330.

BalanceofTreg/Th17cellsandtheexpressionofrelatedtranscriptionfactorsinperipheralbloodofpatientswithcondylomaacuminatum

CHENHua1,2,XIONGQi1,CHENYong-yan1

(1AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China; 2ChongqingQijiangDistrictPeople’sHospital,Qijiang401420,China)

ObjectiveTo evaluate the role and significance of Treg/Th17 cells imbalance in pathogenesis and recurrence mechanism of condyloma acuminatum (CA).Methods52 patients with CA were selected as study group(CA group， 27 with initial occurrence of CA, 25 with recurrence of CA), 30 healthy persons were as control group, flow cytometry was used to detect the proportion of Treg cells and Th17 cells in the peripheral blood, the expression level of Foxp3 mRNA and RORγt mRNA in peripheral blood mononuclear cells was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe proportion of Treg cells and the expression level of Foxp3 mRNA in peripheral blood in CA group was higher than that in control group, recurrence CA group was higher than initial occurrence CA group, difference was significant(bothP<0.05); the proportion of Th17 cells and expression level of RORγt mRNA in CA group was significantly lower than that in control group, proportion of Th17 cells in recurrence CA group was lower than initial occurrence CA group, there was significant difference (bothP<0.05). The proporation of Treg/Th17 in CA group was higher than that in healthy controls(4.60[3.20,8.68] vs 1.39[1.05，2.05],P<0.05), recurrence CA group was higher than initial occurrence CA group (8.19[4.21,10.81] vs 3.52[2.47，4.85],P<0.05).ConclusionThere is an imbalance between Treg cells and Th17 cells in patients with CA, especially in patients with reccurrence of CA， the imbalance of Treg/Th17 cells may play an important role in the pathogenesis and recurrence mechanism of CA.

condyloma acuminatum; Foxp3; RORγt; Treg; Th17; Treg/Th17

[Chin J Infect Control，2017，16(12)：1120-1125]

2017-04-08

贵州省科学技术厅社会发展攻关项目(黔科合SY字[2013]3051号)

陈华(1992-)，女(汉族)，重庆市人，硕士研究生，主要从事皮肤分子生物学研究。

陈永艳 E-mail:cyyzy@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.12.004

R752.5+3

A

1671-9638(2017)12-1120-06

左双燕)