子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

2017-12-06任相亮胡红岩王丹王莹莹李倩马艳

中国棉花 2017年11期

关键词：子叶除草剂转基因

任相亮，胡红岩，王丹，王莹莹，李倩，马艳

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

任相亮，胡红岩，王丹，王莹莹，李倩，马艳*

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

转基因抗除草剂棉花的种植扩大了除草剂的应用范围，但其对靶标除草剂的耐受性及安全性问题需进行综合评价。本研究在转基因抗草铵膦棉花的子叶期喷施农药登记推荐剂量的中剂量（900 g·hm－2）、2 700 g·hm－2、8 100 g·hm－2的草铵膦，系统地评价了草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响。结果表明，喷施8 100 g·hm－2草铵膦后短期内对转基因抗草铵膦棉花叶片叶绿素相对含量（SPAD）值和苗期蚜虫发生数量有一定影响，但随着棉花恢复正常生长，喷施14 d后转基因抗草铵膦棉花叶片SPAD值、Cry1Ac蛋白含量、苗期蚜虫数量与对照无显著差异，后期棉花的生长发育、产量及纤维品质所受影响不大。因此，转基因抗草铵膦棉花在子叶期对草铵膦的耐受性较高。

转基因棉花；草铵膦；子叶期；发育；耐受性

草铵膦属于有机磷类非传导性灭生除草剂，其作用机制主要是抑制植物体内的谷氨酰胺合成酶的催化作用，使植株体内氮代谢紊乱、铵积累过量，叶绿体解体，光合作用受到抑制，植物叶片出现枯萎和坏死现象，最终导致植物死亡[1-2]。

草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，因此转基因抗草铵膦作物的研发应用前景非常广阔。目前，抗草铵膦基因已经成功导入水稻、大豆等20多种作物中，美国的转基因抗草铵膦油菜、棉花、玉米和大豆等已经商业化种植[3]，亚洲、欧洲、澳洲等部分国家已经开始种植部分抗草铵膦作物。继草甘膦后，草铵膦成为世界第二大转基因作物耐受的除草剂品种。

棉花作为重要的天然纤维来源，是第一批实现商业化种植的转基因作物之一。目前，我国的转基因抗除草剂棉花主要是抗2，4-D、溴苯腈、草甘膦、草铵膦等。随着我国棉花生物工程和转基因技术的发展，抗草铵膦棉花有望在我国培育成功和推广应用。因此，本试验选用1种转基因抗草铵膦棉花材料，研究棉花子叶期喷施不同剂量的草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育、外源杀虫蛋白表达以及后期产量、品质的影响，以明确转基因抗草铵膦棉花在子叶期对草铵膦的耐受性，为草铵膦的科学使用和转基因抗除草剂棉花的环境安全性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试棉花材料：转基因（pat/bar+cry1Ac）抗草铵膦棉花品系，由中国农业科学院棉花研究所遗传育种研究室提供。

供试药剂：200 g·L－1草铵膦水剂，购自永农生物科学有限公司（浙江省绍兴市上虞区）。

仪器及设备：SPAD-502 plus叶绿素仪购自日本柯尼卡美能达传感技术股份有限公司；“没得比超绿16型”储压式手动喷雾器（西班牙）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计。试验在中国农业科学院棉花研究所试验农场（河南省安阳县）进行。试验共设4个处理，于棉花子叶期（2015年5月12日）分别喷施有效成分用量为0（清水对照）、900、2 700、8 100 g·hm－2的草铵膦，用水量均为450 kg·hm－2。每个处理3次重复，小区面积25.6 m2（行长8 m，行区4行），随机区组排列。

1.2.2 调查方法。子叶叶绿素相对含量（SPAD值）的测定[4]：各处理于施药 1、3、7、14 d 后的 9：00―16：00，于每小区中间2行随机选取10株棉花，用SPAD值叶绿素测定仪测定棉花2片子叶SPAD值的平均值。

子叶中Cry1Ac蛋白含量的测定[5]：分别在施药1、3、7、14 d后取样，于每个小区中间2行随机选取3株棉花的子叶，冰上保存，带回室内经液氮研磨后，利用Cry1Ab/Cry1Ac定量检测试剂盒（美国EnviroLogix公司）测定Cry1Ac蛋白的含量，即每克鲜叶中Cry1Ac蛋白的质量。

棉花苗期蚜虫数量调查：分别在施药7、14 d后，在每个小区中间2行随机选取10株棉花，调查整株棉花上的蚜虫数量，计算百株蚜量。

棉花长势调查：分别在施药20 d后、棉花始花期（7月14日）和吐絮期（9月21日），随机选取每小区中间2行10株棉花，测量每株棉花的株高、茎直径，记录果枝、花蕾、小铃（直径≤2cm）、大铃（直径＞2cm）、吐絮铃等数量，计算各小区棉花长势参数的平均值。

棉花产量性状调查：10月中旬，从每小区中间2行随机采收50个铃，晒干轧花称量。记录籽棉质量、皮棉质量、棉籽质量、棉籽数，计算铃重、衣分、籽指、衣指等。

纤维品质检测：从每小区获得的棉纤维中随机抽取约100 g样品，由农业部棉花品质监督检验测试中心检测纤维品质，检测指标为：纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率。

1.3 数据分析

数据以“平均值±标准差”表示，选用各重复的平均值进行分析。用SPSS/PASW Statistics 18.0软件进行数据处理和分析，用单因素方差分析（One-way analysis，ANOVA）和 Duncan’s法分析试验结果的差异显著性。根据数据分析结果，利用GraphPad Prism 4.0作图。

2 结果与分析

2.1 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花SPAD值的影响

在转基因抗草铵膦棉花的子叶期喷施草铵膦1 d后，各处理叶片的SPAD值与清水对照差异不明显（图1）；在施药3 d和7 d后，子叶SPAD值则随施药量的增大而降低，2 700 g·hm－2和 8 100 g·hm－2处理3 d后的子叶SPAD值显著低于清水对照；但在施药14 d后，各处理子叶的SPAD值差异不显著。因此，转基因抗草铵膦棉花子叶期喷施草铵膦，1 d后对棉花子叶SPAD值的影响较小，但3 d和7 d后对子叶SPAD值产生影响，而到14 d后子叶SPAD值恢复至正常水平。

图1 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花SPAD值的影响

2.2 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花Cry1Ac蛋白含量的影响

子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花叶片中Cry1Ac蛋白含量的影响不显著（图2）。施药1 d后，不同剂量处理与清水对照相比，棉花子叶的Cry1Ac蛋白含量相差不大，但900 g·hm－2处理的棉花子叶Cry1Ac蛋白含量显著低于8 100 g·hm－2处理；施药3～14 d后，草铵膦处理棉花子叶的Cry1Ac蛋白含量与清水对照差异不明显。因此，在转基因抗草铵膦棉花子叶期喷施草铵膦，1 d后对子叶Cry1Ac蛋白含量有影响，且Cry1Ac蛋白含量随草铵膦剂量的升高而增大，但3～14 d后，棉花子叶Cry1Ac蛋白含量逐渐恢复至正常水平。

图2 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花Cry1Ac蛋白含量的影响

2.3 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花苗期蚜虫发生的影响

本地区棉蚜在子叶期发生较重。在子叶期喷施草铵膦7 d后，8 100 g·hm－2处理棉花的百株蚜量显著低于清水对照（图3）；而在药后14 d，不同剂量处理的棉花百株蚜量与清水对照差异不显著。

图3 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵磷棉花苗期蚜虫数量的影响

2.4 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花长势的影响

在子叶期喷施不同剂量的草铵膦，对转基因抗草铵膦棉花生长的影响较小（表1）。在喷施草铵膦 20 d后，2 700～8 100 g·hm－2处理棉花的株高和茎直径均低于清水对照，但差异不显著，而900 g·hm－2处理棉花的茎直径仅为1.6mm，显著低于清水对照。始花期调查发现，不同剂量草铵膦处理棉花的株高和单株花蕾数与清水对照的差异不显著，但草铵膦8 100 g·hm－2处理棉花的茎直径和单株果枝数显著高于其他处理。吐絮期调查发现，草铵膦不同剂量处理棉花的株高、茎直径、单株果枝数、大铃数、吐絮铃数和总铃数与清水对照差异均不显著，但单株小铃数随施药量的增大而减少。

表1 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花长势指标的影响

2.5 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花产量及纤维品质的影响

与清水对照相比，在子叶期喷施不同剂量的草铵膦，对转基因抗草铵膦棉花的产量及其主要构成因素没有显著影响（表2）。

通过比较各处理棉花的纤维品质，发现不同剂量处理的棉花纤维的上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值等均无规律性变化，但900～2 700 g·hm－2处理棉花纤维的断裂伸长率显著高于 8 100 g·hm－2及清水对照（表3）。

表2 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花产量性状的影响

表3 子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花纤维品质指标的影响

3 讨论

目前草铵膦在国内已登记用于非耕地、果园和蔬菜杂草的防除[6-7]，其有效用量均低于2 200 g·hm－2。有研究表明，在棉花苗期按常规用量900 g·hm－2喷施草铵膦防除棉田杂草，具有防效高、速效性好、持续期长的优点[8]。

前期研究发现，转基因抗草铵膦棉花对1 800 g·hm－2的草铵膦具有较好的耐受性[9]。本研究结果同样显示，转基因抗草铵膦棉花材料在子叶期对草铵膦就具有较高的耐受性。喷施常规剂量3倍和9倍的草铵膦，虽然药后3 d会影响叶片SPAD值，但14 d后棉花能恢复生长，且对叶片中抗虫蛋白Cry1Ac的含量没有显著影响。

棉蚜是棉花苗期的主要害虫。本研究调查了草铵膦不同处理下棉蚜发生量，在施药后一段时间内，其表现为随施药剂量的加大而减少，这主要是由于高剂量草铵膦处理后棉花叶片出现失绿、枯萎的药害症状，不利于棉蚜种群的发生繁殖；但在14 d后随着棉花恢复生长，草铵膦不同处理的蚜虫数量上升到正常水平。

本研究表明，子叶期喷施不同剂量草铵膦对棉花后期生长发育和产量的影响小，虽然对个别小区棉花的小铃数有一定的影响，但对总铃数没有影响，且对棉花产量性状和纤维品质的影响不大。因此，转基因抗草铵膦棉花在子叶期对8100g·hm－2的高剂量草铵膦仍然具有较高的耐受性。

目前，虽然我国转基因抗除草剂棉花品种的研发处于初期，但对目标除草剂的耐受性及安全性研究是转基因棉花环境安全评价技术的重要内容之一。我国农业部已经对抗除草剂玉米、大豆、水稻、油菜等4大转基因作物的除草剂耐受性检测发布了相应的标准，但尚未发布转基因耐除草剂棉花的除草剂耐受性检测相关的技术标准。因此，本研究选用草铵膦棉田推荐用量的中剂量[8]、中剂量的3倍量、中剂量的9倍量评估子叶期喷施草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响，研究结果可为今后研究制定转基因抗除草剂棉花环境安全评价技术方法和标准奠定理论基础，也可为推动我国转基因抗除草剂棉花产业化发展提供技术保障。

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Effects of Glufosinate Ammonium on the Growth and Development of Transgenic Glufosinate-Resistant Cotton at the Cotyledon Stage

Ren Xiangliang,Hu Hongyan,Wang Dan,Wang Yingying,Li Qian,Ma Yan*

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1000-632X（2017）11-0020-04