太阳光激发UVC紫外上转换发光材料Y2SiO5∶Pr3+的灭菌效果研究

2017-12-05刘东阳于增朝杨艳民蔡淑珍

发光学报 2017年12期

关键词：太阳光失活培养皿

刘东阳，于增朝，胡番，陈璐，杨艳民，蔡淑珍

(河北大学物理科学与技术学院，河北保定 071002)

太阳光激发UVC紫外上转换发光材料Y2SiO5∶Pr3+的灭菌效果研究

刘东阳，于增朝，胡番，陈璐，杨艳民*，蔡淑珍*

(河北大学物理科学与技术学院，河北保定 071002)

制备了Y2SiO5∶Pr3+上转换发光材料，首次实现了太阳光激发下的UVC(220～280 nm)紫外上转换发射。为检测紫外(UVC)上转换发光材料的灭菌效果,从土壤中筛选出铜绿假单胞菌并进行培养。为了便于观察，使用Syto9/PI染色剂对细菌着色。实验结果显示：经过太阳光照射后，附着上转换材料的细菌的死亡率比没有上转换材料的细菌有明显的上升。这说明在太阳光的照射下，上转换材料能够将太阳光转化为紫外线并有效灭菌。

Y2SiO5；上转换；铜绿假单胞菌； Syto9/PI

1 引言

上转换发光过程是反斯托克斯过程，它能把两个或多个低能光子转换为一个高能光子[1-3]。目前研究较多的上转换过程是近红外光到可见光上转换[4-6]。Yb3+-Er3+可以实现从980nm到可见光(绿光和红光)上转换发射，目前已被广泛应用于生物标识、临床诊断及治疗[7-9]。然而，到目前为止，关于紫外上转换，特别是UVC紫外上转换的研究还比较少。最近，吉林大学秦伟平实验组对近红外到紫外的上转换进行了研究。然而，从近红外光到UVC转换斯托克斯位移较大，需要较多的光子和较高的激发密度[4，10-11]。与近红外光到紫外发射相比，可见光到紫外发射的斯托克斯位移较小，可以实现较低激发密度下的上转换发射。目前, 上转换发射激发源普遍采用激光，这使其在实际应用上受到了很大限制[12]。采用普通光源，如汞灯、LED灯，其激发面积大，更有实用价值。本实验组在2014年首次实现在300mW蓝光LED激发下的紫外上转换[13]。考虑到太阳光是用之不尽、取之不竭的免费能源，在太阳光激发下的紫外上转换发射更有价值。UVC能被微生物遗传物质DNA有效吸收[14-15]，可在1s之内通过破坏DNA结构杀灭病毒和细菌，常被用于灭菌[16-17]。由于这个波长穿透深度较浅，很难使较深处的细菌失活，从而导致二次污染。可见光的穿透深度比UVC深,并能穿透玻璃器皿，因此采用可见光激发的UVC上转换材料可以对深处污染及器皿内部的细菌进行有效处理。Kim 等在2011年实现了在冷光灯(前加400nm的截止片)激发下的UVC上转换并成功用于灭菌[10]。与灯相比，太阳光可以用于大范围的污水处理。本文制备了Y2SiO5∶Pr3+上转换发光材料，成功地把太阳光转化为UVC发射。

为了研究可见光激发UVC上转换用于灭菌的可行性。我们从土壤中筛选出铜绿假单胞菌并进行培养[18-19]，用Syto9/PI染色剂对铜绿假单胞菌着色[20-21]，研究了太阳光激发下UVC紫外上转换材料Y2SiO5∶Pr3+,Li+对铜绿假单胞菌的影响。

2 实验

2.1材料合成

将5.2g十六烷基三甲基溴化铵、24mL 氨水、100mL 乙醇、240mL 水通过磁力搅拌混合，最终得到均匀的溶液。把7.8mL 的正硅酸乙酯逐滴加入上述溶液中，搅拌至溶液透明。过滤、洗涤、离心后，保持550℃焙烧5h，然后冷却至室温，形成介孔二氧化硅。

通过100W的超声机将0.0359mol硝酸钇、0.00048mol硝酸镨、0.0018mol碳酸锂和0.02mol介孔二氧化硅混合物溶解在去离子水中，将0.12mol氢氧化钠加入以上溶液中(n(OH-)∶n(Y3++Pr3++Li+)=3∶1)，充分搅拌后，溶液被移送至100mL 的高压反应釜中，110℃下保持20h后慢慢冷却至室温。将溶液离心、洗涤、干燥后加热到1100℃，保持4h，最后获得白色的Y2SiO5∶Pr3+,Li+。

2.2细菌制备

将3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl放入1L水中，在电炉上加热使其溶解。用精密pH试纸测量培养基的pH值，用1mol/L的 NaOH将pH调至7.4～7.6，并用多层纱布过滤得到溶液即培养基。将培养基分装于三角烧瓶中，体积不超过烧瓶容积的1/3为宜[22-23]。将已灭菌的培养皿等放置到干燥箱中烘烤，使其快速变干。打开超净工作台的紫外灯，照射30min。通风将培养基冷却至50℃左右。将培养皿边缘和三角烧瓶口在酒精灯上灼烧，然后将培养皿打开，倒入培养基。

将所需的实验用品(均已灭菌)放入超净工作台中，并用75%酒精擦拭，打开酒精灯，灼烧接菌环。取一环铜绿假单胞菌于无菌去离子水中，并搅拌均匀。用滴管把菌液滴于培养基中央，用刮棒涂均匀。将接种菌的培养皿用封口膜封口，做好标记后放入35℃培养箱中倒置培养。

2.3菌液提取及染色

提取菌液：在超净台上，将实验后培养基上的石英片取下来，用一次性胶头滴管吸取4mL 的去离子水滴在菌落中央，再用三角形玻璃棒将菌液刮到相应的试管中，每个培养基里的细菌照此方法提取。

染色过程：装有菌液的试管在温度为4℃、转速为7000r/min的离心机中离心15min。然后,将每个试管中的去离子水倒掉，在每个试管中加入1mL 的0.9% NaCl溶液，震荡均匀。取适量的Syto9/PI的A、B溶液按1∶1混合。将混合液放在小试管中，用移液枪向每个试管中加入3mL 的染色剂混合液，所有的试管在黑暗条件下放置15min。最后，用移液枪在每个试管中取5μL的混合液用共聚焦显微镜观察[10，24-26]。

2.4实验仪器

采用德国布鲁克公司D8ADVANCE X 射线衍射仪测定样品的晶体结构，辐射源为Cu 靶 Kα射线，波长为0.15406nm；管电压为40kV, 管电流为40mA，扫描范围为20～80°。灭菌效果由激光共聚焦显微镜(FV-1000)测得。紫外照片采用南非生产的紫外成像仪(CoroCAM504)拍摄。

3 结果与讨论

3.1材料结构及光谱测试

图1为Y2SiO5∶1.2%Pr3+,9%Li+的X射线衍射图。所有衍射峰的位置和β相Y2SiO5标准卡的位置一致，说明合成了纯相的Y2SiO5。

图1 Y2SiO5∶Pr3+,Li+微米晶的XRD 图谱

图2为紫外成像仪成像原理图。仪器采用双通道成像技术：一个是可见光成像通道，另一个是紫外光成像通道。一个光信号进入成像系统后，光信号被分成两部分，一部分直接进入可见光成像通道，通过透镜后用CCD把可见光信号转化为数字信号。另一部分光信号进入紫外成像通道。这个通道包括紫外凸透镜、日盲滤光片、光电阴极、MCP、光纤、CCD等。紫外透镜用来汇聚入射紫外光，日盲滤光片只允许240～280nm的紫外光通过。该波段紫外光进入系统时，就会被转换为电信号，然后经过MCP放大，最后通过CCD显示出来。

图2 日盲紫外成像仪成像原理

图3 不同太阳能量密度(a)和Li+浓度(b)下的Y2SiO5∶Pr3+,Li+紫外上转换发射

为了确定太阳光能量密度和UVC发射强度之间的关系，采用光学透镜对太阳光进行汇聚，如图3(a)所示 (上面的数字为太阳光能量密度,单位为mW/cm2，下面的数字表示UVC光子数)。数据表明，随着太阳光能量密度的增加，发射的UVC光子数也相应地增加。右边的插图为太阳光能量密度与光子数的对数曲线关系，拟合曲线斜率在低激发密度下为1.12，高激发密度下为0.24，属于双光子上转换过程。图3(b)给出了Li+浓度与UVC光子数的关系。数据表明，9%为最佳的Li+掺杂浓度。

3.2细菌失活研究

3.2.1照射时间对细菌失活的影响

铜绿假单胞杆菌在35℃培养箱中生长3d后，在超净台中揭下培养皿上的封口膜，将适当尺寸的石英片用封口膜固定在培养皿口上。为避免偶然性对实验造成影响，每种情况设置3个平行对照组。在实验组培养皿上的石英片上涂Y2SiO5∶1.2% Pr3+,9%Li+，在另外对照组培养皿上涂同面积的Y2SiO5，分别进行标号。培养皿放在等高度的相同的凸透镜下面，调节凸透镜使照在粉末上光斑的大小相同。分别在0.5，1，2h照射后取走相应培养皿。将实验后的培养皿在超净台中提取菌液，分别放入相应标号的试管中进行染色。用共聚焦显微镜观察，数据如图4所示。

图4未掺杂(左)和Pr3+掺杂(右)的Y2SiO5在相同太阳光能量密度、不同照射时间下的细菌失活情况。(a)0.5h；(b)1h；(c)2h(红色代表死菌,绿色代表活菌)。

Fig.4Confocal scanning laser micrographs of pseudomonas aeruginosa biofilms with un-doped (left) and doped (right) Pr3+phosphors under different irradiation time. (a)0.5h. (b)1h. (c)2h (red represented dead bacteria, green represented living bacteria).

从图4可以看到，未掺杂Pr3+离子的样品和掺杂Pr3+离子的样品都能导致细菌的失活，且随着照射时间的增加，死亡的细菌也增加；但掺杂Pr3+的样品在相同照射时间下的细菌失活率明显高于未掺杂样品。

3.2.2太阳光能量密度对细菌失活的影响

在超净台中将12个培养好细菌的培养皿上的封口膜揭下，适当尺寸的石英片被固定在培养皿上。在其中6个培养皿石英片上涂Y2SiO5∶1.2% Pr3+,9% Li+，在另外6个培养皿石英片上涂Y2SiO5，使每个石英片上粉末的量和面积都相等。将粉末中加Pr3+的6个培养皿标上1～6号，将另外6个培养皿标上7～12号。1～3号和7～9号6个培养皿放在凸透镜(直径9cm，焦距40cm)下面，调节凸透镜使照在粉末上光斑的面积相同；另外6个培养皿放在太阳光下直射，2h后完成灭菌实验。将实验后的培养皿在超净台中提取菌液，分别放入相应标号的试管中，离心染色后，用共聚焦显微镜观察分析灭菌效果[27-33]。

图5不同能量密度太阳光照射下的共聚焦显微镜下的细菌照片。(a)未聚光，经Y2SiO5处理；(b)未聚光，经Y2SiO5∶1.2% Pr3+,9% Li+处理；(c)聚光，经Y2SiO5处理；(d)聚光，经Y2SiO5∶1.2%Pr3+,9%Li+处理。

Fig.5Confocal scanning laser micrographs of pseudomonas aeruginosa biofilms coated with different phosphor under different energy density. (a) Y2SiO5under sunlight. (b) Y2SiO5∶Pr3+under sunlight. (c) Y2SiO5under converged sunlight. (d) Y2SiO5∶Pr3+under converged sunlight.

图5给出了太阳光能量密度对灭菌效果的影响。从图中可以看出太阳光经过透镜汇聚后，Pr3+掺杂Y2SiO5样品的细菌失活率明显增加。

4 结论

低激发密度下的紫外上转换，特别是在太阳光激发下的紫外上转换在生物医学、环境保护、防腐治污等方面都有广泛的应用。本文首次报道了在太阳光激发下的Pr3+、Li+共掺杂Y2SiO5荧光体的紫外上转换发射，分析了Li+浓度及太阳光能量密度对上转换发射强度的影响，并探讨了不同太阳光能量密度和照射时间下UVC紫外上转换灭菌效果。实验结果表明，经过太阳光照射后，附着上转换材料的细菌的死亡率比没有上转换材料的细菌有明显的上升。这说明在太阳光的照射下，上转换材料能够将太阳光转化为紫外线并有效灭菌。

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SterilizingEffectofUVCwithPr3+DopedY2SiO5UnderTheSunlight

LIUDong-yang,YUZeng-chao,HUFan,CHENLu,YANGYan-min*,CAIShu-zhen*

(CollegeofScienceandTechnology,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

*CorrespondingAuthors,E-mail:mihuyym@163.com；cai-shuzhen@126.com

UVC (220-280nm) up-conversion(UC) emission was achieved for the first time under the sunlight. To test UC UVC germicidal efficacy of Pr3+doped Y2SiO5phosphors, the verdigris pseudomonad were extracted from soil and used for the experiments. The bacteria were stained by Syto9/PI. Experiment results show that the mortality rate of bacteria adheres to UC phosphor increases markedly under sunlight radiation. It indicates that UC UVC materials can effectively kill bacterium under the sunlight.

Y2SiO5; up-conversion; verdigris pseudomonad; Syto9/PI

2017-08-15；

2017-10-12

国家自然科学基金(50902042); 河北省自然科学基金(E2010000283)资助项目

Supported by National Natural Science Foundation of China(50902042);Natural Science Foundation of Hebei Province(E2010000283)

1000-7032(2017)12-1591-06

O482.31

10.3788/fgxb20173812.1591