麻杏石甘汤对哮喘模型大鼠肺组织STAT4及其mRNA表达的影响

虞琳 潘建伟 叶乐平

麻杏石甘汤对哮喘模型大鼠肺组织STAT4及其mRNA表达的影响

虞琳 潘建伟 叶乐平

目的 研究麻杏石甘汤对哮喘模型大鼠肺组织STAT4及其mRNA表达的影响，探讨其在哮喘治疗中的作用及可能机制。方法 将55只SPF级SD大鼠随机分为5组，对照组（A组）、哮喘组（B组）、高、中、低剂量麻杏石甘汤+哮喘组（C组、D组、E组），每组11只。采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏与雾化吸入激发法制作哮喘模型。留取肺泡灌洗液（BALF）测定IL-12及IL-13水平；并取肺组织标本HE染色后观察气道炎症，免疫组化法及原位杂交法分别检测STAT4及其mRNA表达。结果 （1）哮喘组大鼠BALF中IL-13水平升高，IL-12水平下降，肺组织炎症细胞浸润明显。（2）STAT4及STAT4 mRNA在各组大鼠气道平滑肌及血管肌层中均有表达，正常对照组呈阳性表达，哮喘组阳性表达最弱。（3）麻杏石甘汤干预后哮喘大鼠IL-13水平下降，IL-12水平上升，炎症反应减轻；STAT4表达上调，其中高剂量组与哮喘组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量、中剂量麻杏石甘汤组STAT4 mRNA表达与哮喘组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 卵蛋白致敏大鼠气道及血管肌层STAT4表达受抑制，麻杏石甘汤可能通过上调STAT4及其mRNA的表达，减轻哮喘大鼠气道炎症反应。

哮喘 麻杏石甘汤 STAT4 STAT4 mRNA

近10余年来，我国儿童支气管哮喘（简称哮喘）患病率从 2000年的 1．97%上升为2010年的 3.02%[1]，严重影响儿童身心健康，给家庭及社会造成极大负担。气道慢性炎症被公认为是哮喘发病的中心环节。信号转导及转录激活因子4（signal transduction and activator of transcription 4，STAT4）作为一种新型转录因子家族成员，在哮喘气道炎症和气道高反应形成中的调控作用备受关注[2]。麻杏石甘汤作为祛痰、平喘中成药在历史上应用已久，现代药理学研究亦证实其具有镇咳、祛痰、平喘、解热的功效，但对哮喘作用的具体机制尚未明确，对STAT4的影响国内更未见报道。因此，笔者拟通过建立卵蛋白致敏哮喘大鼠模型，观察STAT4及其mRNA在肺组织中的表达，进一步探讨麻杏石甘汤对气道炎症的作用及可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 55只SPF级幼年雄性SD大鼠（购自温州医科大学实验动物中心），体重120～180g；卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）、焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）、氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司）；大鼠IL-12、IL-13 ELISA试剂盒（美国R&D公司）；STAT4兔抗大鼠多克隆抗体（美国Abcam公司）；STAT4原位杂交检测试剂盒、多聚甲醛、水合氯醛（武汉博士德生物公司）；二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒、苏木素染液（北京中衫金桥）；HE染色试剂盒（江苏碧云天生物工程有限公司）；其余试剂为市售分析纯试剂。

1.2 麻杏石甘汤的制备 麻黄6g、杏仁6g、甘草5g、石膏20g（购自温州医科大学附属第二医院），麻杏石甘汤的煎制参照卫生部国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》。双蒸水浸泡麻黄、杏仁、甘草30min，煮石膏20min，后同煎15min，留取第一道汁后，再加入双倍双蒸水煎15min，取汁，混合第一、二道汁，浓缩至相应体积，高、中、低剂量中药组体积分别为50ml、100ml、200ml，含生药 24.6g/kg、12.3g/kg、6.15g/kg。于 4℃冰箱保存备用。

1.3 实验动物分组及处理 将大鼠随机分为对照组(A组)、哮喘组（B组）、哮喘+高剂量麻杏石甘汤组（C组）、哮喘+中剂量麻杏石甘汤组（D组）、哮喘+低剂量麻杏石甘汤组（E组），每组11只。哮喘模型的制作分致敏和激发两阶段。致敏阶段：B组～E组大鼠于第1天和第8天分别注射OVA和氢氧化铝凝胶的无菌抗原液1ml,A组予等量的0.9%氯化钠溶液。激发阶段:第2次致敏1周后，将B组～E组大鼠放入自制的密闭有机玻璃箱（40cm×30cm×20cm）中，予含1%OVA的0.9%氯化钠溶液雾化吸入，1次/d，每次持续30min，连续定时激发3d；A组用0.9%氯化钠溶液替代OVA进行。C组～E组在第2次致敏后第4天开始分别予不同浓度麻杏石甘汤灌胃，2次/d，激发阶段则每次激发前后4h灌胃同等剂量麻杏石甘汤。

1.4 标本的制备 末次激发24h后予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射，后行腹主动脉切开处死。即刻切开气管，切取左肺中下段组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋后切片。经气管插管行右肺灌洗，留取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）8ml（10ml分2次灌洗，回收率确保在80%以上），离心后取上清液-80℃冻存备用。

1.5 BALF中IL-12和IL-13水平测定 应用Sandwich ELISA法检测BALF中IL-12、IL-13的表达水平。实验过程参照试剂说明书进行。

1.6 免疫组化法检测STAT4的表达 切片脱蜡后高压修复3min，3%H2O2灭活内源性酶后冲洗，5%山羊血清封闭非特异性抗体，37℃水浴箱孵化30min，滴加STAT4兔抗鼠多克隆抗体（1∶200），4℃过夜；复温后滴加生物素标记二抗山羊抗兔的IgG37℃孵化30min，冲洗后行DAB染色，苏木素复染，PBS返蓝后脱水、透明、封片，显微镜下观察。阳性结果呈棕黄色，用图像分析仪IPP6.0测定肺组织平均吸光度值（IOD）作为STAT4相对水平。

1.7 原位杂交法检测STAT4 mRNA的表达 石蜡切片常规脱蜡后用3%H2O2灭活内源性酶，3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化，滴加采用经地高辛标记的针对STAT4的寡核苷酸探针杂交液，封闭后再加入生物素化兔抗地高辛，染色、封片。阳性细胞着色呈棕黄色。同用图像分析仪IPP6.0测定肺组织平均吸光度值（IOD）作为STAT4 mRNA相对水平。

1.8 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者采用Tamhane’s T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比较 B组BALF中IL-13水平显著高于A组，不同剂量麻杏石甘汤组中均较哮喘组低，其中C、D组与B组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。与A组相比，哮喘组IL-12水平明显下降，而采用麻杏石甘汤干预后BALF中IL-12水平随着麻杏石浓度升高而升高。详见表1。

表1 各组大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比较（pg/ml）

2.2 麻杏石甘汤对大鼠气道炎症的影响 A组大鼠气道、血管形态规整，气道平滑肌及血管肌层无增生，未见明显炎性细胞浸润，肺泡腔无明显渗出。B组大鼠气道、血管肌层明显增生，周围嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润明显，基底膜增厚，部分气道上皮脱落，管腔内可见黏液栓，肺间质增宽。麻杏石甘汤组肺组织炎性细胞浸润、血管平滑肌增生均较B组减轻，且随着剂量的增高，改善越显著。详见图1（见插页）。

2.3 麻杏石甘汤对STAT4表达的影响 STAT4主要表达于正常大鼠气道及血管肌层（0.3617±0.0812），呈棕黄色强阳性表达，在B组大鼠表达减少，其IOD为0.1396±0.0711，麻杏石甘汤干预后B组STAT4表达上调，其中C组IOD为0.2251±0.0540，差异有统计学意义（P＜0.05）。D组IOD 为 0.1872±0.0396，E组为 IOD 为0.1539±0.0306，与B组比较无统计学差异。详见图2（见插页）。

2.4 麻杏石甘汤对STAT4 mRNA表达的影响 A组大鼠气道及血管肌层均可见STAT4 mRNA呈棕黄色阳性表达（0.2848±0.0616），B 组大鼠 STAT4 mRNA 表达（0.1671±0.0532）较A组明显减弱（P＜0.05）。麻杏石甘汤灌胃后大鼠气道肌层及血管亦可见STAT4 mRNA阳性表达，且表达强于B组，其中C组（0.2193±0.0722）、D组（0.1962±0.0708）与B组比较有统计学差异（P＜0.05）。详见图3（见插页）。

3 讨论

哮喘发病率逐年攀升,目前我国儿童哮喘的总体控制水平尚不理想[3]，对其发病机制的深入探索一直是学者研究的重点。STATs是一种新型的转录因子家族成员，可进入细胞核内直接结合DNA调控靶基因转录，在介导多种细胞因子和趋化因子的信号转导过程中起到关键作用[4]。在目前已发现的7种STATs家族成员中，STAT1、STAT4、STAT6与哮喘气道炎症和重塑中关系是哮喘防治领域的热点问题，其中STAT4在CD4+T细胞向辅助性T淋巴细胞1（Th1）分化中起着至关重要的作用[5-6]。经典免疫学认为，Th1/Th2细胞在数量、活化及功能方面的比例失衡是哮喘发病的核心环节。Th1主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ，Th2则通过分泌 IL-4、IL-13 等细胞因子，诱导趋化因子介导肺部炎症，诱导分泌免疫球蛋白 E（immunglobulin E，IgE），促进黏液高分泌，加重气道高反应（airway hyperresponsiveness，AHR），还可直接刺激成纤维细胞参与气道重塑，在变态反应中起着独特而重要的作用[7]。

本研究应用卵蛋白致敏建立哮喘大鼠模型，激发过程中可见哮喘组大鼠表现烦躁不安、呼吸急促、四肢颤动、毛色失去光泽，严重者四肢瘫软，俯伏不动，呼吸节律不规则。留取标本时可见哮喘大鼠肺脏体积增大、肿胀，可见不规则暗红色充血区。哮喘大鼠肺组织切片HE染色见气道平滑肌及血管肌层增生，与对照组相比，周围炎性细胞（嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞）大量浸润，部分气道上皮损伤、脱落。同时，与正常组比较，哮喘大鼠BALF中Th2细胞因子IL-13明显升高，Th1细胞因子IL-12减少，证实存在Th1/Th2比例失衡，表明哮喘模型复制成功。

IL-12与受体结合后，可引起STAT4磷酸化、同源二聚化及核易位[8]，从而诱导其下游的CD4+T细胞向Th1 分化，促进 IFN-γ 的表达[1，5-6，9-10]。当 STAT4 缺乏时，CD4+Th1的分化和IFN-γ的表达受到抑制，CD4+Th1的完整分化需要STAT4和T-bet共同参与[10]。本实验通过免疫组化、原位杂交法从蛋白及基因水平发现，STAT4及STAT4 mRNA在各组大鼠气道平滑肌及血管肌层中均有表达。哮喘组大鼠STAT4及STAT4 mRNA的表达显著低于正常对照组，提示哮喘时气道平滑肌和血管肌层的STAT4基因转录、蛋白翻译均受到抑制。笔者推测，哮喘时肺组织中IL-12等Th1细胞因子分泌不足，STAT4表达减少，间接促进了Th2的优势分化，参与哮喘气道炎症的发病。但Dulek等[11]应用呼吸道合胞病毒（RSV）感染STAT4-/-小鼠的研究发现，STAT4基因敲除的小鼠亦未能产生Th2优势应道，没有出现AHR、粘液高分泌及嗜酸性粒细胞聚集等现象。Kim等[12]研究也发现IL-13介导的Th2哮喘表型，如AHR和非嗜酸性炎症等，也必须依赖IL-12-STAT4-IFN-γ轴。说明STAT4在哮喘发病中的作用除了减少Th1的形成，在促进Th2细胞因子表达方面可能也发挥了重要作用。本研究仅从IL-12、IL-13及STAT4基因、蛋白的层面进行阐述，STAT4通路相应的其他上游及下游细胞因子、结合蛋白等具体信号途径尚未研究，特别是对Th2细胞因子的具体作用及机制，还有待更深入的研究。

近年来中西医结合治疗儿童哮喘受到越来越多学者的重视，一些中草药已被证实具有抗炎、抗过敏及免疫调节的作用，最新的国内儿童哮喘指南[13]也将中药提入治疗方案中。麻杏石甘汤出自张仲景的《伤寒论》，由麻黄、杏仁、炙甘草、石膏四味药组成，具有辛凉宣肺、清热平喘的功效。现代药理研究证实麻黄所含的麻黄碱为β2受体激动剂，可舒张支气管平滑肌痉挛；杏仁所含的苦杏仁苷经酶水解后产生氢氰酸，可使呼吸运动趋于安静而奏止咳平喘作用，并能促进动脉壁前列腺I2（PGI2）样物质生成，扩张微血管，改善微循环；生石膏的成分主要为含水硫酸钙对支气管神经肌肉有抑制及镇静作用，加上钙质能降低支气管通透性，故有解除支气管痉挛的作用[14]。笔者前期研究已发现，麻杏石甘汤能下调哮喘大鼠气道上皮STAT6及STAT6 mRNA的表达，抑制IL-13的分泌[15]。本研究发现麻杏石甘汤能减轻卵蛋白致敏大鼠激发后的躁动不安、呼吸急促等表现，减少气道EOS浸润。进一步研究发现，哮喘大鼠在不同浓度麻杏石甘汤灌胃后，BALF中IL-13有不同程度的下调，IL-12水平上升，气道平滑肌及血管肌层STAT4及STAT4 mRNA表达均有增强。因此笔者推测麻杏石甘汤可能通过促进Th1细胞因子分泌，间接抑制Th2，上调STAT4表达，进而减少EOS的浸润，减轻气道炎症反应。国内有报道认为麻杏石甘汤可调节哮喘小鼠Th1/Th2平衡，但主要通过STAT6等途径[16]。本研究中麻杏石甘汤的方剂剂量根据人及动物间药物换算公式所得，若能有标准化片剂等制型，相信实验数据将更具有指导意义。

综上所述，麻杏石甘汤能上调Th1细胞因子IL-12的表达，下调Th2细胞分泌，促进肺组织中STAT4的表达，减少哮喘大鼠气道炎症，参与哮喘防治的调控，为其在哮喘现代临床应用提供了依据。相信随着哮喘机制研究的进一步深入，临床麻杏石甘汤片剂、STAT4制剂等的研发，将为哮喘的中西医结合治疗提供更广阔的空间。

[1] 全国儿科哮喘协作组,中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所.第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查[J].中华儿科杂志,2013,51(10):729-735.

[2] Loisel D A,Du G,Ahluwalia T S,et al.Genetic associations with viral respiratory illnesses and asthma control in children[J].Clin Exp Allergy,2016,46(1):112-124.

[3] Wong G W,Kwon N,Hong J G,et al.Pediatric asthma control in Asia:phase 2 of the Asthma Insights and Reality in Asia-Pacific(AIRIAP 2)survey[J].Allergy,2013,68(4):524-530.

[4] Pykalainen M,Kinos R,Valkonen S,et al.Association analysis of common variants of STAT6,GATA3,and STAT4 to asthma and high serum IgE phenotypes[J].J Allergy Clin Immunol,2005,115(1):80-87.

[5] Schulz E G,Mariani L,Radbruch A,et al.Sequential polarization and imprinting oftype 1 Thelper lymphocytes by interferon-gamma and interleukin-12[J].Immunity,2009,30(5):673-683.

[6] Thieu VT,Yu Q,Chang H C,et al.Signaltransducer and activator of transcription 4 is required for the transcription factor T-bet to promote T helper 1 cell-fate determination[J].Immunity,2008,29(5):679-690.

[7] Gallelli L,Busceti M T,Vatrella A,et al.Update on anticytokine treatment for asthma[J].Biomed Res Int,2013,2013:104315.

[8] Kaplan M H.STAT4:a critical regulator of inflammation in vivo[J].ImmunolRes,2005,31(3):231-242.

[9] Nguyen KB,Watford WT,Salomon R,et al.Criticalrole for STAT4 activation by type 1 interferons in the interferon-gamma response to viralinfection[J].Science,2002,297(5589):2063-2066.

[10] Szabo S J,Sullivan B M,Peng S L,et al.Molecular mechanisms regulating Th1 immune responses[J].Annu Rev Immunol,2003,21:713-758.

[11] Dulek D E,Newcomb D C,TokiS,et al.STAT4 deficiency fails to induce lung Th2 or Th17 immunity following primary or secondary respiratory syncytialvirus(RSV)challenge but enhances the lung RSV-specific CD8+T cell immune response to secondary challenge[J].J Virol,2014,88(17):9655-9672.

[12] Kim Y S,Choi S J,Choi J P,et al.IL-12-STAT4-IFN-gamma axis is a key downstream pathway in the development of IL-13-mediated asthma phenotypes in a Th2 type asthma model[J].Exp MolMed,2010,42(8):533-546.

[13] 中华医学会儿科学分会呼吸学组,编辑委员会中华儿科杂志.儿童支气管哮喘诊断与防治指南 (2016年版)[J].中华儿科杂志,2016,54(3):167-181.

[14] 桑杲,陈志敏.麻杏石甘汤治疗小儿支气管哮喘的药理研究及临床应用进展[J].浙江中医杂志,2006,41(6):366-368.

[15] 虞琳,朱丽君,张怡静,等.麻杏石甘汤对哮喘大鼠气道上皮STAT6和黏蛋白表达的调控[J].医学研究杂志,2014,43(5):40-44.

[16] 黄丰,童晓云,张荣华,等.麻杏石甘汤调节哮喘模型小鼠Th1/Th2反应的机制初探[J].中药材,2008,31(10):1519-1522.

Expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction

YU Lin,PAN Jianwei,YE Leping.
Department of Pediatrics,the Fourth Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine,Yiwu 322000,China

Objective To investigate the expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction. Methods Fifty five SPF SD rats were randomly divided into 5 groups:control group(group A),asthma group(group B),high-dose,medium-dose and low-dose Maxingshigan Decoction treatment groups(group C,group D,group E).The rat model of asthma was established by ovalbumin(OVA)challenge methods.The bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues were obtained.The concentrations of IL-12 and IL-13 in BALF were measured by ELISA,the inflammation of airways was observed by HE staining;the expressions of STAT4 protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization,respectively. Results Compared with the control group,the concentration of IL-13 in BALF of asthma group was higher,while it was decreased in Maxingshigan Decoction treatment groups of asthma rats.On the contrary,the concentration of IL-12 in BALF was lower in asthma group than that in control group.The IL-12 levels in BALF were increased in Maxingshigan Decoction groups,and compared with asthma rats,the levels in groups C and D were significantly elevated(P＜0.05).HE staining showed airway smooth muscle and vascular muscle hyperplasia and peripheral inflammatory cells infiltration in asthma rats.Maxingshigan Decoction dose-dependently alleviated the pathological changes in asthma rats.STAT4 and its mRNA were expressed in airway smooth muscles and vascular muscle layers in all groups.The expression of STAT4 in Maxingshigan Decoction groups was higher than that in control group,and the expression of STAT4 protein in group C was significantly higher than that in asthma group (P＜0.05).The expression of STAT4 mRNA in groups C and D were significantly up-regulated compared with the asthma group (P＜0.05). Conclusion Chinese medicine Maxingshigan Decoction can reduce airway inflammation in asthma rats through up-regulation of STAT4 expression.

Asthma Maxingshigan Decoction STAT4 STAT4 mRNA

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.21.2017-1672

322000 义乌，浙江大学医学院附属第四医院儿科（虞琳、潘建伟）；温州医科大学附属第二医院儿童呼吸科（叶乐平）

叶乐平，E-mail：yeleping@163.com

2017-07-13）

严玮雯）