响应面优化纤维素酶提取蓝莓多糖工艺研究

孙丽娜，范英兵，胡冬慧，杨源涛，林宇童

（黑河学院 理学院，黑龙江黑河164300）

响应面优化纤维素酶提取蓝莓多糖工艺研究

孙丽娜，范英兵*，胡冬慧，杨源涛，林宇童

（黑河学院 理学院，黑龙江黑河164300）

采用响应面法优化野生蓝莓多糖提取工艺，并对多糖的脱色工艺进行优化。在单因素的试验的基础上，选定酶添加量、酶解时间和酶解温度三因素三水平，采用Design-Expert软件进行响应面试验设计和结果分析，得到纤维素酶法提取蓝莓多糖的优化条件为：酶添加量0.57%，酶解时间85 min，酶解温度38℃，提取率2.91%；各因素的影响顺序为：酶解温度>酶添加量>酶解时间。

响应面法；纤维素酶；蓝莓；提取

蓝莓，别称蓝浆果、红豆果、乌饭树、越桔等，是杜鹃花科越橘属植物[1]。因其果味鲜美、营养丰富，被誉为“浆果之王”[2]，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[3]。我国野生蓝莓主要分布在长白山、大兴安岭和小兴安岭地区，且大部分在大兴安岭地区。

蓝莓果实中含有原花青素、花色苷、酚酸、微量元素多种活性成分，具有抗癌、强心、明目、防止脑神经老化、软化血管、增强机体免疫力等药理活性[4-5]。蓝莓中也含有多糖成分，糖是重要的生命活性物质之一，涉及到人体多细胞生命的全部空间和时间，而多糖作为糖类中的重要一类，又具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、抗衰老及降血糖等功能[6-7]。由于多糖在提取时，往往成分中含有色素、蛋白质等杂质，因此必须要对多糖进行纯化。目前，大孔吸附树脂作为一种廉价、高效的高分子吸附材料，被越来越多的应用于多糖的脱色研究[8-9]。

本试验以黑河地区野生蓝莓味研究对象，探究蓝莓多糖的提取的最佳工艺条件，采用大孔吸附树脂为脱色剂，研究其对蓝莓多糖脱色的最佳工艺条件，寄希望本研究为蓝莓多糖工业化的提取及脱色操作提供一定的理论依据。

1 材料、试剂与设备

1.1 材料与试剂

野生蓝莓：大兴安岭地区；纤维素酶（30 U/mg，生化级）：Rubio公司；D101型大孔吸附树脂：天津市光复精细化工研究所；无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸、乙醇等均为国产分析纯：国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水。

1.2 设备

FW-100型粉碎机：上海世邦有限公司；DK-98-II型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；JA20-03N型电子天平：上海平轩科学仪器有限公司；DZ-2BCII型真空干燥箱：上海贤德实验仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型真空抽滤装置：郑州赛克斯玻璃仪器有限公司；DZF6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；T6紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HH-4型数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司

2 方法

2.1 蓝莓多糖的提取工艺流程

新鲜蓝莓→干燥至恒重→粉碎，过筛→加水50倍搅拌均匀→调节pH7.0→加入纤维素酶→100℃灭酶15 min→Sevage法除去蛋白→大孔吸附树脂脱色→醇沉→抽滤→乙醚、丙酮洗涤抽滤→真空干燥得到蓝莓粗多糖→称重

2.2 蓝莓多糖提取的单因素试验

固定料液（蒸馏水）比为1∶50（g/mL），分别以酶的添加量、酶解时间、酶解温度为影响因素，进行单因素试验，考察对蓝莓粗多糖提取率的影响。

2.3 响应面分析法

在单因素的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取合适的因子，进行三因素三水平试验，以多糖提取率为响应值，利用Design Expert 8.0统计软件对试验数据进行分，因素水平表设计见表1。

表1 响应面优化试验因素水平表Table 1 The table of experiment factors and levels optimized by response surface

2.4 蓝莓粗多糖提取率的计算

蓝莓粗多糖提取率的计算公式如下：

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 酶添加量对蓝莓多糖提取率的影响

酶添加量对蓝莓多糖提取率的影响见图1。

图1 酶添加量对蓝莓多糖提取率的影响Fig.1 The effects of the additive amount of enzyme

由图1可以看出，随着酶添加量的增加，蓝莓多糖提取率增加，这一阶段影响蓝莓提取率的主要因素是酶含量；在酶添加量达到0.6%时，蓝莓多糖的提取率达到了最大；继续增大酶添加量，蓝莓多糖提取率的增加不明显，这时影响蓝莓多糖提取率的主要因素是底物的量，增加酶用量，蓝莓多糖提取率无明显增加，而且会增大成本。因此，较佳酶添加量0.6%。

3.1.2 酶解时间对蓝莓多糖提取率的影响

酶解时间对蓝莓多糖提取率的影响如图2。

图2 酶解时间对蓝莓多糖提取率的影响Fig.2 The effects of the time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

由图2可知，随酶解时间的增加，蓝莓多糖提取率有明显增大，但在前90 min内增加趋势明显。90 min后，反而有所下降。这是由于随着水解时间的增加，部分多糖水受到破坏。因此，为保证提取率同时保证有效成分完好，较佳酶解时间为60 min左右。

3.1.3 酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响

酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响见图3。

图3 酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响Fig.3 The effects of the temperature of enzymolysis

由图3可以看出，酶解温度40℃时，蓝莓多糖的提取率最大，随温度的升高，蓝莓多糖提取率反而有所下降，主要由于酶活性与温度有关，温度过高，会破坏酶结构，使酶失去活性，温度过低，酶催化作用不能充分发挥，因此，较佳酶解温度在40℃左右。

3.2 响应面分析法

3.2.1 响应面分析法的设计

利用Box-Benhnken的设计原理，共设计17个试验点，其中1号～12号是析因设点，13号～17号零点，析因点为自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估算试验误差。试验结果见表2。

表2 Box-Benhnken试验方案设计及结果Table 2 The design and results of Box-Benhnken experiments

以蓝莓多糖的提取率为响应值Y，通过Design-Expert软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程如下：

3.2.2 回归模型方差分析

回归模型的方差分析结果见表3。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 The result of the variance analysis on regression models

由表3可以看出，模型F检验结果为P=0.000 2<0.01，表明该回归方程模拟及其显著，且模型失拟项P=0.568 2>0.05不显著，复相关系数R2=0.968 2，说明模型拟合程度较好。校正系数RAdj2=0.927 2说明该模型能解释92.72%响应值的变化，仅有总变异7.29%不能用此模型来解释。因此，可以用此模型来分析和和预测纤维素酶提取蓝莓多糖的工艺条件。

由表 3 中的方差分析结果可知，A、B、C、A2、B2、C2对蓝莓多糖的提取率影响均显著，影响的主次顺序为C>A>B，即酶解温度>酶添加量>酶解时间。

3.2.3 最佳条件的确定

酶添加量和酶解时间对蓝莓多糖提取率的影响见图4，酶添加量和酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响见图5，酶解时间和酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响见图6。

图4 酶添加量和酶解时间对蓝莓多糖提取率的影响Fig.4 The effects of the addictive amount and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

图4、图5、图6可以看出，酶添加量、酶解时间及酶解温度的两两因素之间对蓝莓多糖的提取率影响不大，也就是交互作用不显著。

响应面预测的最佳试验组酶添加量为0.57%，酶解时间84.47 min，酶解温度37.57℃。该条件下蓝莓多糖的提取率为2.917 62%。

图5 酶添加量和酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响Fig.5 The effects of the temperature and addictive amount of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

图6 酶解时间和酶解温度对蓝莓多糖提取率的影响Fig.6 The effects of the temperature and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

3.3 验证试验

为验证响应面试验的可行性，响应面试验优化后得到的最佳反应条件进行试验，考虑到试验和生产中实际操作的可行性和便利性，酶添加量0.57%，酶解时间75 min，酶解温度38℃。最佳条件验证试验结果见表4。

表4 最佳条件验证试验结果Table 4 The best condition validation experiment results

由表4可知，3组验证试验结果中平均得率为2.91%。与理论值相差0.076 2%，因此，响应面法对纤维素酶辅助提取蓝莓多糖的工艺优化是可行的。并且具有实际应用价值。

4 结论

本试验研究采用纤维素酶法提取蓝莓多糖，该工艺通过酶水解破坏植物细胞壁的作用，使细胞内多糖物质充分溶出，从而提高了蓝莓多糖的提取率。通过响应面试验可得到：影响因素的顺序酶解温度酶添加量酶解时间；纤维素酶法提取蓝莓多糖的最佳条件为：酶添加量0.57%，酶解时间85 min，酶解温度38℃，提取率达到2.91%。与模型预估值接近，说明用响应面法优化得到的模型准确、可靠。试验所建立的工艺条件酶用量少、条件温和、材料易得、价格低廉、提取率高，为蓝莓多糖的产业化开发提供依据。

[1]方仲相,胡君艳.蓝莓研究进展[J].浙江工业大学学报,2013,30(4):599-606

[2]胡雅馨,李京,惠伯棣.蓝莓果实中主要营养及花青素成分的研究[J].食品科学,2006,27(10):600-603

[3]顾姻,贺善安.蓝浆果与蔓越桔[M].北京:中国农业出版社,2001

[4]孙贵宝.蓝莓的保健作用及各国栽培发展趋势[J].农机化研究,2002(3):225

[5]李颖畅,孟宪军.蓝莓果主要物质含量及处理方式对花色苷的影响[J].食品工业科学,2008,29(5):163-164

[6]王秀菊.蓝莓干酒及蓝莓酒渣花色苷提取工艺的研究[D].泰安:山东农业大学,2010

[7]李颖畅,王亚丽,齐凤元,等.响应面法优化蓝莓叶多糖提取工艺[J].食品工业科技,2015,36(3):227-231

[8]黄显章,冯芸,尹玲,等.大孔吸附树脂用于葛根美容添加剂提取液的脱色研究[J].时珍国医国药,2010,21(8):2077

[9]姚文华,尹卓容.大枣多糖脱色的工业化研究[J].天然产物分离,2006,4(1):6

[10]杨丽勇.蓝莓的营养保健功能及其产品开发[J].中国食物与营养,2007(4):24-25

[11]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,1999

[12]孙磊,乔善义,赵毅民.黑骨藤多糖含量测定方法研究[J].中国中药杂志,2009,34(10):1241-1244

Optimization of Cellulose Extraction of Blueberry Polysaccharide by Response Surface Methodology

SUN Li-na，FAN Ying-bing*，HU Dong-hui，YANG Yuan-tao，LIN Yu-tong
（College of Science，Heihe College，Heihe 164300，Heilongjiang，China）

The extraction process of wild blueberry polysaccharide was optimized by response surface methodology，and the decolorization process of polysaccharide was optimized.On the basis of single factor test，the three factors and three levels of enzyme addition，enzymolysis time and enzymolysis temperature were selected.The design experiment and result analysis were carried out by using Design-Expert software to obtain the method of enzymatic extraction of blueberry polysaccharide The optimum conditions were as follows：enzyme addition amount 0.57%，enzymolysis time 85 min，enzymolysis temperature 38℃，extraction rate 2.91%；the influence order of each factor was：enzymolysis temperature>enzyme dosage>enzymolysis time.

response surface methodology；cellulose；blueberry；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.010

黑河学院科学技术研究重点项目（KJZ201502）；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（201613744022）

孙丽娜（1983—），女（汉），助教，硕士研究生，研究方向：天然药物化学。

*通信作者：范英兵（1984—），男，讲师。

2017-05-03