阔叶杨桐花粉离体萌发和花粉管生长特性的研究

(菏泽学院生命科学系， 山东 菏泽 274000)

阔叶杨桐花粉离体萌发和花粉管生长特性的研究

张瑞菊
(菏泽学院生命科学系， 山东 菏泽 274000)

研究了不同浓度的蔗糖和硼酸，在不同温度和培养时间内对阔叶杨桐花粉萌发率和花粉管生长的影响，以期为阔叶杨桐的繁殖育种研究提供依据。结果表明： 1) 不同浓度的蔗糖和硼酸处理组之间存在显著性差异，蔗糖和硼酸都能促进杨桐花粉萌发和花粉管的生长，但超过一定浓度则会起到抑制作用； 2) 随着培养温度的升高，花粉萌发率和花粉管长度呈先升后降的趋势； 3) 随着培养时间的延长，花粉萌发率和花粉管长度逐渐增加，但最初的前12 h内花粉萌发快，在培养的前9 h内花粉管生长较快。 4) 实验显示：阔叶杨桐花粉培养的最适培养基是15%蔗糖和0.02%硼酸，最适培养温度为25 ℃，培养24 h后花粉萌发率为84.32%，花粉管长达2 003.51μm。

阔叶杨桐； 五列木科； 花粉； 萌发率； 花粉管生长

阔叶杨桐(AdinandralatifoliaL.k.Ling)原为广义山茶科(Theaceae)杨桐属植物[1]，APGIII分类系统[2]将其划入厚皮香科(Ternstroemiaceae)又称五列木科(Pentaphylacaceae)。该植物为乔木，主要生于南方森林中，对维持生态系统的稳定性有重要作用；因其具有漂亮的花和紫色浆果，也常常被用作庭院植物。阔叶杨桐子房内具有特殊的复合胎座，其子房上部为5心皮形成的中轴胎座，在子房下部5心皮则形成一个空腔，空腔内还有一个类似基底胎座的结构[3]。两部分胎座的胚珠均可以受精发育成种子，而且种子都能萌发[4]。阔叶杨桐特殊的胎座与五列木科其它植物的中柱胎座不同[5]，在分类学上具有非常重要的意义。有关两部分胎座上胚珠的受精过程及其生殖生物学的研究至今未见报道。

作为雄配子体，花粉活力会直接影响植物的授粉、受精和种子质量[6-7]。花粉离体萌发所需条件与活体萌发比较接近[8]，且葡萄糖和硼酸常常被用于花粉萌发和花粉管生长特性的研究[7-8,10-14]。本实验研究了蔗糖、硼酸、培养温度和时间对阔叶杨桐花粉萌发率和花粉管生长的影响，旨在探索花粉萌发的最适条件，估测花粉管活体萌发的长度，为研究阔叶杨桐的生殖生物学和花粉管活体萌发途径提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验以昆明植物园内阔叶杨桐为材料，于盛花期7—8月选择即将开放的花蕾，连同一段枝叶一起采下，将枝条迅速插入带水的容器中带回实验室，待花粉完全散出后，收集备用。

1.2 花粉培养方法

采用液体培养法，将花粉均匀散布于载玻片凹槽内的液体培养基上[9],于黑暗处25 ℃恒温培养箱保湿培养24 h，然后在显微镜下统计花粉萌发率并测量花粉管长度，每处理组随机统计100粒花粉和20条花粉管，3次重复。当花粉管长度超过花粉粒直径时判为萌发[8]。

萌发率(%)=萌发花粉数/花粉总数×100%。

1.3 实验设计

1.3.1 最适蔗糖浓度

在探讨蔗糖对花粉萌发的影响时，以不含蔗糖的BK培养基[9]为对照，设置5个蔗糖浓度梯度(5%、10%、15%、20%、25%)进行实验。

1.3.2 最适硼酸浓度和最适培养基的选择

将筛选出的最适蔗糖浓度作为BK培养基的蔗糖浓度，其他3种成分不变，然后把硼酸设置7个浓度梯度(0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.07%)进行实验，本实验以不含硼酸的培养基为对照。

1.3.3 最佳培养条件

采用筛选的最适培养基，设置5个温度梯度(20，25，30，35，40 ℃)和8个时间梯度(1，3，6，9，12，18，24，36 h)，对阔叶杨桐花粉进行黑暗恒温培养，以确定花粉的最佳培养条件。

1.4 数据处理

实验结果用Excel作图，用SPSS 9.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蔗糖的影响

不同的蔗糖浓度对杨桐花粉萌发和花粉管生长的影响不同，花粉萌发率与花粉管长度变化趋势基本一致。如图1所示，不含蔗糖的对照组花粉萌发率(24.38%)和花粉管长度(135.32μm)均是最低的。随着蔗糖浓度的升高，花粉萌发率升高，同时花粉管长度也在增加，15%的蔗糖使花粉萌发率和花粉管长度达到最大值，分别为75.63%和1 136.72μm，是对照组的3.10倍和8.40倍。20%和25%的蔗糖则使花粉萌发率和花粉管长度降低。方差分析结果显示，不同蔗糖浓度的各组实验间均存在显著差异(p<0.05)。由此可见，一定浓度的蔗糖可以加速花粉萌发和花粉管的生长，15%蔗糖为最适浓度，高于15%的蔗糖则使花粉萌发和花粉管的生长受到抑制。

图1 蔗糖浓度对阔叶杨桐花粉萌发和花粉管生长的影响(ck表示未加蔗糖)。

2.2 硼酸的影响

硼酸对杨桐花粉萌发的影响与蔗糖相似，在一定浓度范围内可提高花粉萌发率并加速花粉管生长。如图2所示，硼酸浓度为0.01%～0.02%时，随着硼酸浓度增加，花粉萌发率迅速上升，在硼酸浓度为0.02%时，萌发率最大，为84.32%，是对照组的3.31倍。硼酸浓度为0.03%～0.07%时，随着浓度增加，花粉萌发率直线下降；当硼酸浓度为0.07%时，花粉萌发率为15.39%，明显低于对照组的(25.49%)。说明低浓度硼酸促进花粉萌发；高浓度硼酸抑制花粉萌发。花粉管长度与花粉萌发率变化趋势不同，硼酸浓度为0.02%时，花粉管为2 003.51μm，为对照组的5.35倍，硼酸浓度为0.03%时，花粉管最长，为2 057.24μm。硼酸浓度>0.03%时，随着硼酸浓度增加，花粉管长度则显著下降。方差分析显示：各处理组花粉萌发率和花粉管长度与对照组之间均存在显著差异(p<0.05)，0.02%和0.03%的硼酸对花粉萌发率的影响有显著差异(p<0.05)，而对花粉管长度的影响无显著差异(p>0.05)，综合萌发率和花粉管长度两方面的因素，认为0.02%的硼酸为花粉培养的最适浓度，含15%蔗糖和0.02%硼酸的培养基为杨桐的最适培养基。

图2 硼酸浓度对阔叶杨桐花粉萌发和花粉管生长的影响(ck表示未加硼酸)

2.3 不同培养温度的影响

在最适培养基中，不同培养温度对花粉萌发率和花粉管长度的影响不同，但温度对萌发率和花粉管长度影响的变化趋势基本一致。如图3所示：恒温(25 ℃)培养时，花粉萌发率和花粉管长度最大，分别为84.32%和2 003.49μm；温度高于25 ℃，特别是35 ℃和40 ℃时，萌发率和花粉管长度分别为37.48%、23.19%和723.10，538.24μm，明显低于20 ℃时的57.33%和830.52μm，各处理组之间呈显著差异(p<0.05)。因此可以得出：25 ℃为最适温度，高于或低于此温度都会造成花粉萌发率和花粉管长度降低。

图3 不同温度对阔叶杨桐花粉萌发和花粉管生长的影响

2.4 不同培养时间的影响

如图4所示，阔叶杨桐花粉在15%蔗糖+0.02%硼酸的培养基中，25 ℃恒温培养，随着培养时间的延长，花粉萌发率越高，花粉管长度也越长(图5 A-E)。在培养9 h和12 h时，花粉萌发率增加分别为5.86%/h和7.38%/h，12 h后花粉萌发率快速减少，18 h时，萌发率增速为0.87%/h。花粉管的长度随培养时间的延长而增加，但其生长速度呈先快后慢的趋势。在3 h时，花粉管增长速度最快，为175.96μm/h；在9 h时为106.83μm/h；9 h后增长速度明显减慢，为34.00μm/h。24～36 h时，花粉萌发率和花粉管长度增加很小(分别为85.57%-84.34%=1.23%；2 004.87-2 004.14=0.73μm)。由此可知，花粉萌发率和花粉管长度随时间延长，其数值均增大，其增速均为先快后慢，其拐点分别为12 h和9 h。经检验，各处理组之间存在显著差异(p<0.05)。

图4 不同培养时间对阔叶杨桐花粉萌发和花粉管生长的影响

3 讨 论

蔗糖、硼酸、培养温度和时间都能影响花粉萌发和花粉管生长，随着培养基中蔗糖和硼酸浓度及培养温度的增加，均表现为先升后降的变化趋势，在培养初期花粉管长度增加较快，9 h后增加速度减慢；杨桐花粉的最适培养条件为25 ℃、15%蔗糖+0.02%硼酸培养基，萌发率为84.32%。

培养基中添加蔗糖不仅使花粉与培养基保持渗透平衡，也为花粉萌发和花粉管生长提供营养物质[8,15]。在一定范围内，蔗糖对对花粉萌发和花粉管生长起促进作用，蔗糖浓度过低，花粉渗透压变小，花粉壁容易破裂；蔗糖浓度过高，则使代谢物堆积抑制花粉萌发[9]。该实验中蔗糖为15%时，杨桐花粉内外渗透压保持平衡，萌发率高，花粉管生长快。花粉离体培养中，不同植物花粉培养的最适蔗糖浓度不同，例如：杏为15%或20%[8]矮牡丹为9%[11]、果梅[12]、薄皮核桃为20%[9]、桔梗为10%[13]等，造成其差异的原因可能是物种遗传特性不同或花粉渗透压不同[16]。

硼主要分布于花的柱头和子房，能够促进糖的吸收和代谢，同时硼还参与细胞壁中果胶的合成[16-17]，进而促进花粉管的生长。很多研究结果表明，一定浓度的硼酸使花粉萌发率升高并且加速花粉管的生长，否则会降低花粉萌发率并抑制花粉管生长。例如果梅的最适硼酸浓度为0.01%[12]、桃花为0.1%[16]、杏为0.01%[8]、矮牡丹为0.0045%[11]、薄壳山核桃为0.02%～0.03%[9]、菠萝蜜为0.025 g/L[12，18]等。本实验中0.02%的硼酸萌发率最高，而0.03%的硼酸花粉管生长最快，花粉萌发率和花粉管生长的最适硼酸浓度不同，这与硼酸对金银忍冬花粉离体培养[19]的影响结果一致，原因可能是花粉萌发和花粉管生长对硼酸的敏感性不同[19]。

注：A为0.5 h；B为1 h；C为3 h;D为6 h;E为9 h;F为12 h.图标:A=20 μm;B=50 μm;C～F=100 μm。图5 25 ℃下不同培养时间花粉管生长情况

适宜的温度是花粉保持较高萌发率和花粉管快速生长的重要条件，温度过高或过低都会严重影响花粉萌发和花粉管生长[8]。温度低时，花粉活性弱，从而降低花粉萌发率并减缓花粉管生长；温度过高时，花粉新陈代谢加快，易导致花粉管破裂，同样不利于花粉生长。花粉萌发的最适温度因物种不同而有所差异：薄壳山核桃为25 ℃[9]、拟南芥为22 ℃[20]、杏为25 ℃[8]、桔梗为30 ℃[13]。本实验中，阔叶杨桐花粉培养的最适温度为25 ℃，昆明1971—2000年间7月和8月的平均气温分别为19.8 ℃和19.4 ℃[21]，昆明昼夜温差较大，白天温度一般都接近25 ℃，而本实验是在恒温条件下进行的。另外，高温对花粉离体萌发和活体萌发的影响不同：花粉离体萌发证实高温会抑制花粉管的萌发和花粉管生长[8]，但徐臣善等发现，高温促进苹果花粉在柱头表面快速萌发，加速其在花柱内的生长，但不能完成受精作用[22]。Beppu等发现，高温加速甜樱桃珠心和胚囊的降解，无法完成受精[23]。鉴于花粉离体萌发和活体萌发的不同及昆明气温情况，对于以观察杨桐花粉管进入胚囊途径为目的的实验，人工辅助传粉不宜选择温度较低的早晨和温度过高的正午。

培养时间同样会影响花粉萌发率和花粉管长度，本实验中，培养时间越长，花粉萌发率和花粉管长度数值越大但9 h前花粉生长快，9 h后生长变慢。Suwan提出，二核花粉管在自养阶段和异养阶段生长快，在二者过渡阶段生长慢[24]。陈迪新等发现，沙梨花粉在柱头内生长具有“快-慢-快”特点[25]，证实了Suwan的观点。本实验为离体萌发，与花粉在柱头内原位萌发可能有所不同，所以在人工传粉研究花粉管在花柱中生长时，应该适当延长传粉后的采花时间，以保证实验采样完全。

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Characteristics of Pollen Germination and Pollen Tube Growth ofAdinandralatifoliaL.k.Ling InVitro

ZHANGRuiju
(Department of Life Scicence,Heze University,Heze Shandong 274000,China)

The study examined pollen germination and pollen tube growth ofAdinandralatifoliacultured with different sucrose and boric acid concentration at different temperatures and culturing times,and the aim is to provide the evidence for the breeding.The results showed that 1) There was a significant difference among different concentration treatments,sucrose and boric acid promoted pollen germination and pollen tube growth,but this function would reverse if overrun certain concentration; 2) Pollen germination rate and the length of pollen tube increased first and decreased afterwards with the rise of temperature; 3) Pollen germination rate and pollen tube length increased with the culturing time lasting,and pollen germinated rapidly during the first 12 hours of culturing; while the pollen tube grow faster within 9 h after cultured than any other time. 4) The research suggested that the optimum culture medium consist of 15% sucrose+0.02% H3BO3,and the pollen germination percentage was nearly 84.32%,and the average pollen tube length reached 2 003.51μm after 24 h incubation at 25 ℃.

AdinandralatifoliaL.k.Ling; pentaphylacaceae; pollen; germination rate;pollen tube growth

2017-01-13

菏泽学院博士基金项目(XY 13 BS 02)。

张瑞菊(1968—)，女，山东菏泽人；博士研究生，研究方向：植物发育和系统分类；E-mail：shangqian_0@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.040

Q 944.42

A

1001-4705(2017)07-0040-05