肠道病毒71型VP1抗原表位多肽疫苗的实验研究

向云凤 宋惠玲 苟恩进 李 青 顾胜利 韩 允 汤正珍 黄 波

肠道病毒71型VP1抗原表位多肽疫苗的实验研究

向云凤1宋惠玲1苟恩进1李 青2顾胜利2韩 允2汤正珍2黄 波2

目的 根据贵州省手足口病患儿肠道病毒71型(EV71)分离株的VP1结构蛋白序列研制多肽疫苗并研究其对小鼠的免疫保护作用。方法 2013年3月1日至2015年12月31日从贵州省手足口病患儿的咽拭子样本中分离到17株EV71毒株，其VP1氨基酸序列一致(共297个氨基酸)，据此设计并合成多肽片段(除最后一段为27个氨基酸外，其余均为20个氨基酸)；用感染EV71的手足口病病愈患儿的阳性血清，通过间接ELISA法筛选出免疫原性较好的多肽片段，制成多肽疫苗；用多肽疫苗免疫ICR健康雌鼠，并设未免疫的对照(Con)；将雌鼠的子代小鼠随机分为注射和不注射EV71病毒颗粒的2个亚组；注射病毒2 d后处死所有小鼠，分别取小鼠的骨骼肌、小肠和脑组织，通过RT-PCR检测病毒感染情况，同时HE染色后在显微镜下观察病理改变。结果 共设计并合成19段含交叉序列的多肽片段，从中筛选出3段免疫原性较好的(P2：VSRALTHALPAPTGQNTQVS；P4：ALQAAEIGASSNASDESMIE；P8：YANWDIDITGYAQMRRKVEL)， 制成多肽疫苗并免疫雌鼠，取雌鼠的子代小鼠进行后续试验。RT-PCR结果显示，各感染病毒亚组的骨骼肌、小肠和脑组织中均能检测到EV71病毒，而未感染病毒亚组均检测不到；病理结果显示，未接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后，骨骼肌、小肠和脑组织均出现明显的炎性改变；接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的炎性改变明显减轻，3种多肽疫苗对EV71所致炎症的改善作用无明显差异；接种多肽疫苗母鼠的未注射病毒亚组子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织中均未检测到EV71病毒，也未观察到明显的炎性改变。结论 本研究成功制备VP1抗原表位多肽疫苗并在动物实验中证实了其有效性和安全性，可为今后相关疫苗的研制提供方法学借鉴。

手足口病； 肠道病毒EV71； 结构蛋白VP1； 多肽疫苗； 贵州

临床上尚无治疗手足口病的特异性药物, 以对症支持治疗为主。肠道病毒71型(EV71) 是手足口病常见病原体。EV71灭活疫苗(2015年获批)的Ⅲ期临床试验结果显示其预防EV71引起的手足口病的保护率分别为90%和80%以上[1-3]。然而，EV71的分子流行病学研究表明[4]，EV71基因突变发生频繁，具有遗传多样性。

EV71的结构蛋白VP1暴露于病毒表面，是重要的抗原表位，为中和抗体结合位点，能刺激机体产生中和抗体，故以VP1为主体的疫苗可能有很好的免疫原性。贵州省遵义市第一人民医院2013年3月1日至2015年12月31日从全省手足口病患儿的咽拭子样本中共分离到17株EV71毒株，比对发现其VP1氨基酸序列一致。本研究拟根据该段VP1的氨基酸序列设计不同的多肽片段，筛选出免疫原性较好的制成VP1抗原表位多肽疫苗，研究其对小鼠的免疫保护作用，从而为研制对贵州地区手足口病更有针对性的EV71新型疫苗提供方法。

1 方法

1.1 VP1多肽片段的设计合成 根据VP1氨基酸序列设计并合成含交叉序列的多肽片段，每段多肽片段由15个氨基酸加下游的5个氨基酸构成共20个氨基酸的多肽序列，最后一段共27个氨基酸。多肽片段的合成由重庆WesternBiotechnology公司完成。

1.2 EV71感染手足口病病愈患儿IgG阳性血清的筛选 分离EV71病毒株时收集同期证实为EV71感染且处于恢复期不同时间的手足口病病愈患儿血清，采用人肠道病毒71型IgG抗体ELISA试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)检测血清抗EV71的IgG抗体，筛选显色最深即抗体浓度最高的血清进行后续实验。

1.3 VP1多肽片段的筛选 将1.1中设计合成的多肽片段包被固相载体ELISA板，每条多肽设4个重复孔，加入1.2中筛选得到的EV71感染手足口病病愈患儿的阳性血清，4个重复孔中的血清浓度梯度依次为1∶100、1∶200、1∶400和1∶800，37℃孵育1 h，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(北京索莱宝科技有限公司，货号：SE101)，37℃孵育1 h，底物显色后测定吸光度，筛选出免疫原性较好(OD值较高且数值具有较好梯度)的多肽片段。

1.4 多肽疫苗免疫方法及效果判断 本研究中6～8周龄ICR健康雌鼠和雄鼠购自北京华阜康生物科技股份有限责任公司。①将1.3中筛选出的多肽分别用0.9%氯化钠溶液溶解，终浓度为1 mg·mL-1，再与同体积的弗氏完全佐剂混合，制成多肽疫苗。②将多肽疫苗0.1 mL经腹腔注射6～8周龄ICR健康雌鼠，每种多肽疫苗接种4只雌鼠，1周后重复免疫1次，并设置对照(不接种疫苗，4只雌鼠)。③将接种疫苗和不接种疫苗的雌鼠分别与雄鼠合笼。④从各多肽疫苗免疫和不疫苗雌鼠的子代小鼠中取32只，随机分为2个亚组(各16只)，1个亚组出生后立即予腹腔注射5×107TCID50(半数组织培养感染剂量)的EV71病毒颗粒(前期实验分离纯化的EV71病毒经过感染RD细胞培养增殖后获取)，另1个亚组不注射病毒。⑤注射病毒2 d后全部处死2个亚组小鼠，分别取小鼠的骨骼肌、小肠和脑组织各2份。1份标本抽提RNA后行RT-PCR[宝生物工程(大连)有限公司生产的试剂盒]检测病毒感染的情况，EV71的PCR引物序列如下，F：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’，R：5’-ACCCAWAGTAGTCGGTTCCGC-3’；另1份标本经HE染色后，在显微镜下观察病理改变。

2 结果

2.1 VP1多肽片段的合成及筛选 设计并合成19段含交叉序列的多肽片段P1～19，序列详见表1。

表1 19段多肽片段的氨基酸序列

任意选择在EV71监测时段的手足口病恢复期不同时间的6例患儿血清，ELISA检测显示感染后第19天患儿血清中IgG抗体浓度最高。以此IgG阳性血清通过间接ELISA法共筛选到3段免疫原性较好的多肽片段，分别为P2、P4和P8，其在VP1氨基酸序列中的相应位置分别为16～35、46～65、106～125。

2.2 雌鼠接种VP1多肽疫苗后对新生小鼠感染EV71的免疫保护作用 以P2、P4和P8多肽片段制成多肽疫苗并免疫雌鼠，同时设立未免疫的对照，子代小鼠相应地表示为P2、P4、P8和对照组(Con)，各组小鼠均再分为感染病毒亚组(v)和未感染病毒亚组(u)，以EV71引物行RT-PCR，图1显示，感染病毒亚组小鼠的骨骼肌、小肠和脑组织中均检测到EV71病毒，未感染病毒亚组小鼠均未检测到。

骨骼肌病理观察结果(图2)：未感染病毒亚组(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)小鼠骨骼肌肌纤维形状较为一致，大小均匀，肌细胞无明显病变。感染病毒亚组(E～I)小鼠骨骼肌肌纤维均出现不同程度的骨骼肌炎症改变，其中Con-图2E和F病变最重，可见部分肌纤维肿胀、萎缩、断裂、横纹消失，间质灶状出血，局部散在淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润；P2-G、P4-H和P8-I 小鼠骨骼肌病理改变较Con轻，仅见少数肌纤维萎缩；P2、P4和P8之间相互比较，病变程度未见明显差异。

小肠病理观察结果(图3)：未感染病毒亚组小鼠小肠组织未见明显病理改变(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)。感染病毒亚组小鼠小肠组织均出现不同程度的病理改变，其中Con-E和F病变最重，可见小肠黏膜出血，伴少量中性粒细胞浸润，肠黏膜上皮及腺上皮细胞部分肿胀，空泡变性明显；P2-G、P4-H和P8-I小鼠肠组织病理改变较Con轻，仅可见肠黏膜上皮及腺上皮细胞部分肿胀，部分空泡变性；P2、P4和P8组间比较，病变程度未见明显差异。

图1各组小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的EV71病毒核酸PCR检测结果

注 采用琼脂糖凝胶电泳，1～8分别代表P2-v、P2-u、P4-v、P4-u、P8-v、P8-u、Con-v和Con-u组，M:分子量标志物。用本文EV71引物经RT-PCR扩增后目的条带为508 bp

图2各组小鼠骨骼肌病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分别为未感染病毒亚组P2、P4、P8和Con，未见明显病变。感染病毒亚组中，E、F为Con，骨骼肌部分肌纤维肿胀(上箭头)、萎缩(下箭头)，局部散在淋巴细胞和单核细胞浸润(左箭头)，间质灶状出血(右箭头)；G、H和I分别为P2、P4和P8，均可见少数肌纤维萎缩，组间无明显差异

图3各组小鼠小肠组织病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分别为未感染病毒亚组P2、P4、P8和Con，未见明显病变。感染病毒亚组中，E、F为Con，小肠黏膜组织部分肿胀(右箭头)、空泡变性(下箭头)，黏膜伴中性粒细胞浸润(上箭头)，黏膜出血(左箭头)；G、H和I分别为P2、P4和P8，均可见少量小肠黏膜上皮肿胀、空泡变性，组间无明显差异

脑组织病理观察结果(图4)：未感染病毒亚组小鼠脑组织细胞大小正常，染色均匀，未见明显病理改变(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)。感染病毒亚组小鼠脑组织均出现不同程度的病理改变，其中Con-E病变最重，可见脑组织明显水肿，部分神经元出现胞浆肿胀、核偏位等变性和坏死；P2-F、P4-G和P8-H小鼠脑组织病变较Con轻，可见脑组织轻度水肿，少数神经元出现胞浆肿胀、核偏位等变性；P2、P4和P8组间相互比较，病变程度未见明显差异。

图4各组小鼠脑组织病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分别为未感染病毒亚组P2、P4、P8和Con，未见明显病变。感染病毒亚组中，E为Con，脑组织明显水肿，部分神经元胞浆肿胀、核偏位等变性(右箭头)及坏死(下箭头)；F、G、H分别为P2、P4和P8，均可见少数神经元胞浆肿胀、核偏位，组间无明显差异。

3 讨论

EV71是引起手足口病的主要感染病原。少数手足口病患儿可出现无菌性脑膜炎、脑炎和急性迟缓性麻痹等神经系统病变，严重者导致脑干脑炎、神经源性肺水肿甚至死亡，这类患儿即使存活也常留有不可逆的后遗症，严重威胁儿童的健康。在目前缺乏特异性抗病毒药物治疗手足口病的情况下，开展EV71疫苗相关研究对有效控制手足口病疫情至关重要。

目前，国内唯一投入临床使用的EV71疫苗是灭活疫苗，通过将C4亚型EV71毒株(FY-23K-B)接种于人二倍体细胞，经培养、病毒收获、灭活和纯化后，加入氢氧化铝佐剂和甘氨酸稳定剂制成[5]。本课题组前期对贵州省各地区的EV71分离株进行遗传进化分析表明，贵州地区流行的EV71基因型与国内其他地区流行的EV71基因型一致，均属于C4a亚型，故国内已投入使用的疫苗对预防贵州省EV71型手足口病预防是是有效的。但是，我们同时发现，EV71病毒基因组存在碱基突变的情况。有研究表明，EV71基因具有变异快速的特点，年进化率约为1.35×10-2/核苷酸[6]。也有研究表明EV71存在基因重组现象[7]。一旦EV71重组病毒获得进化优势，就会成为新的主导类型，可能导致新型手足口病病毒感染呈聚集性爆发，届时现有EV71灭活疫苗的免疫效能可能会降低。因此，研发EV1新型疫苗十分重要。

VP1是EV71病毒的主要抗原决定簇之一。目前，国内外已有多位学者对EV71 VP1亚单位疫苗进行了相关研究。Foo等[8]利用VP1区域合成多条多肽片段免疫小鼠，并进行血清中和抗体检测，发现某些片段能较好地刺激小鼠产生中和抗体。Chang等[9]用EV71毒株免疫小鼠，筛选出具有中和活性的单克隆抗体，用合成的VP1多肽片段进行体外单抗中和表位检测，发现中和单抗能与VP1某些区域特异性结合。

本研究根据贵州省EV71分离株的VP1氨基酸序列设计并合成19条多肽片段，用EV71感染手足口病病愈患儿的阳性血清筛选出3段免疫原性较好的片段，制成多肽疫苗后免疫雌鼠，待小鼠出生后腹腔注EV71病毒颗粒，通过观察小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的病理改变研究多肽疫苗免疫雌鼠后对小鼠的保护作用。结果表明，未接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后，骨骼肌、小肠和脑组织均出现明显的炎性改变；接种多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小肠和脑组织的炎性改变明显减轻，表明用本研究研制的VP1多肽疫苗免疫母鼠后对小鼠有较好的免疫保护作用。3种多肽疫苗对EV71感染引起的炎症的改善作用无明显差异，表明筛选出的3段多肽片段均有较好的免疫原性。同时，单纯接种3种多肽疫苗的小鼠骨骼肌、小肠和脑组织中均未检测出EV71病毒，也未见明显的炎性改变，证实了VP1抗原表位多肽疫苗的安全性。本研究采用EV71感染患儿的阳性血清来筛选多肽片段，此方法筛选出的多肽片段可能具有更好的代表性，更能有效地刺激人体产生中和抗体。

与灭活疫苗相比，抗原表位多肽疫苗具有以下优势：①更适用于应对EV71病毒的变异；②能达到快速、高效生产的要求, 降低疫苗制作的成本；③疫苗中无完整的病毒结构, 安全性较高。本研究成功制备VP1抗原表位多肽疫苗并在动物实验中证实了其有效性和安全性，可为今后相关疫苗的研制提供方法学借鉴。

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2017-09-01

2017-09-19)

(本文编辑：孙晋枫)

ExperimentalstudyoftheepitopepeptidevaccineagainstthestructuralproteinVP1ofenterovirus71strain

XIANGYun-feng1,SONGHui-ling1,GOUEn-jin1,LIQing2,GUSheng-li2,HANYun2,TANGZheng-zhen2,HUANGBo2

(1GraduateSchoolofZunyiMedicalCollege,Zunyi, 563000，China; 2DepartmentofPediatrics,TheThirdAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi563000，China)

HUANG Bo, E-mail: 672879381@qq.com

ObjectiveTo make the epitope peptide vaccine by using the structural protein VP1 of enterovirus 71 (EV71) strain isolated from Guizhou area and investigate the immune protective effects on mice.MethodsThe VP1 amino acid sequences of 17 EV71 strains isolated from throat swab samples of children patients with hand-foot-mouth disease between March 1, 2013 and December 31, 2015 in Guizhou area were consistent(a total of 297 amino acids). Peptide fragments were designed and synthesized by using the amino acid sequence, that the last one was 27 amino acids, the others were 20 amino acids. The epitope peptide vaccine was made by using the polypeptide fragments with better immunogenicity, which was screened out by indirect ELISA method and IgG positive serum of children who recovered from EV71 infection. Then the epitope peptide vaccine was used to protect healthy ICR female rats and the control group was set that female rats weren't inoculated (con). The neonatal rats were randomly divided into 2 subgroups of injected and non injected EV71 virus. The mice were killed 2 days after injection of the virus, then the tissue was harvested from the skeletal muscle, the small intestine and brain of all neonatal rats which was used to check EV71 virus by RT-PCR and agarose gel electrophoresis and observed the pathological lesion by Hamp;E.Results3 peptide vaccines were made by using polypeptide fragments with better immunogenicity screened from 19 segments polypeptide fragments with cross sequences. The female mice were immunized by using the peptide vaccines and the subsequent experiments were carried out in neonatal rats. RT-PCR results showed that EV71 virus could be detected in infected groups, could not be detected in uninfected groups. The pathological lesion showed that skeletal muscle, intestine and brain tissue had obvious inflammatory changes in the neonatal rats infected with EV71 virus but the female mice weren't immunized. Inflammatory changes were significantly alleviated in the neonatal rats infected with EV71 virus and the female mice were immunized, there was no significant difference in each tissue between the three vaccinated groups. No obvious inflammatory lesion was found in each tissue of the neonatal rats which didn't infected with EV71 virus and the female mice were immunized.ConclusionIn our study, VP1 epitope peptide vaccine was successfully prepared, and its efficacy and safety were confirmed in animal experiments, it can provide methodological reference for the development of related vaccines in the future.

hand-foot-mouth disease; enterovirusEV71; VP1; Epitope peptide vaccine; Guizhou

国家自然科学基金项目：81260292；遵义市科技局科技计划基金项目：遵市科合社字【2013】14号；遵义市科学技术基金项目遵市科合人才【2015】24号；遵义市“15851人才精英工程”培养人才在研项目经费资助项目：2013-20

1 遵义医学院研究生院 贵州遵义，563000；2 遵义医学院第三附属医院儿童重症医学科 贵州遵义，563000

黄波，E-mail:672879381@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.05.013