不同化疗方案对多发性骨髓瘤患者T细胞亚群及相关细胞因子水平的影响

宋丽丽，张 日，潘迎英⋆，郜 晓

（1.张家港市中医医院肿瘤血液科，江苏 张家港 215600；2.苏州大学附属第一医院血液科，江苏 苏州 215000）

不同化疗方案对多发性骨髓瘤患者T细胞亚群及相关细胞因子水平的影响

宋丽丽1，张 日2，潘迎英⋆1，郜 晓1

（1.张家港市中医医院肿瘤血液科，江苏 张家港 215600；2.苏州大学附属第一医院血液科，江苏 苏州 215000）

目的：探讨不同化疗方案对多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者T淋巴细胞亚群和相关细胞因子水平的影响。方法：将2011年6月至2013年12月期间张家港市中医医院肿瘤血液科收治的60例MM患者随机分为硼替-地塞组（30例）和VAD-沙利组（30例）。为硼替-地塞组患者采用VD方案（硼替佐米+地塞米松）进行化疗，为VAD-沙利组患者联合应用改良的VAD方案（长春新碱+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺进行化疗，并对比两组患者治疗的效果及治疗前后其调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)、辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)、IL-6（白细胞介素-6）、IL-17（白细胞介素-17）和TGF-β（转化生长因子-β）的水平。结果：硼替-地塞组患者治疗的总有效率高于VAD-沙利组患者，治疗后其Treg的水平高于VAD-沙利组，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：与联合应用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治疗MM的临床效果更好。

多发性骨髓瘤；硼替佐米；沙利度胺；细胞因子；辅助性T细胞17；调节性T细胞

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种血液系统恶性肿瘤。此病的发病原因主要是患者骨髓中的浆细胞发生异常的克隆性增生[1]。临床研究发现[2]，MM患者的血液循环中常存在T淋巴细胞与细胞因子的异常表达，前者主要包括调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)和辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)等，后者主要包括白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。相关的临床研究证实，Treg与Th17的水平与

MM的发生、发展密切相关。为了对比用VD方案与联合应用改良的VAD方案和沙利度胺治疗MM的临床效果，笔者对张家港市中医医院肿瘤血液科收治的60例MM患者进行了对照研究。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象的纳入标准

病情符合《血液病诊断及疗效标准》（第三版）中规定的MM的诊断标准。2）Durie-Salmon分期为Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅲ期。

1.2 研究对象的临床资料

选取2011年6月至2013年12月期间张家港市中医医院肿瘤血液科收治的60例MM患者。将这60例患者随机分为硼替-地塞组（30例）和VAD-沙利组（30例）。硼替-地塞组患者中有男24例，女6例；其年龄在58岁至72岁之间，平均年龄（64.2±3.7）岁；其中Durie-Salmon分期为Ⅰ期的患者有5例，为Ⅱ期的患者有18例，为Ⅲ期的患者有7例；其中血中M蛋白类型为IgG型的患者有12例，为IgA型的患者有8例，为IgM型的患者有5例，为轻链型的患者有5例。VAD-沙利组患者中有男23例，女7例；其年龄在58岁至70岁之间，平均年龄（63.1±2.6）岁；其中Durie-Salmon分期为Ⅰ期的患者有6例，为Ⅱ期的患者有18例，为Ⅲ期的患者有6例；其中血中M蛋白类型为IgG型的患者有14例，为IgA型的患者有6例，为IgM型的患者有3例，为轻链型的患者有7例。两组患者的一般临床资料相比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.3 治疗方法

为硼替-地塞组患者采用VD方案进行化疗。具体的化疗方法是：1）在对患者进行化疗的第1天、第4天、第8天、第11天，使用1.3 mg/m2的硼替佐米（商品名：万珂，由西安杨森制药有限公司生产）对其进行静脉推注，1次/d。2）在对患者进行化疗的第1天、第2天、第4天、第5天、第8天、第9天、第11天、第12天，使用20 mg/m2的地塞米松对其进行静脉滴注，1次/d。3）治疗28天为1个周期，应连续治疗2个周期。为VAD-沙利组患者联合应用改良的VAD方案和沙利度胺进行化疗。具体的化疗方法是：1）让患者口服沙利度胺（商品名：反应停，由常州制药厂有限公司生产）进行治疗，开始用药时每天服100 mg。然后，根据患者的耐受情况逐渐为其增加用药量（每周最多增加50 mg），直至用药量达到200 mg/d。2）将0.5 mg的长春新碱加入到20 ml的生理盐水中，对患者进行静脉注射，1次/d。用药时间为对患者进行化疗的第1天和第4天。3）将l0 mg的表柔比星加入到20 ml的生理盐水中，对患者进行静脉注射，1次/d。用药时间为对患者进行化疗的第1天和第4天。4）将40 mg的地塞米松加入到250 ml的生理盐水中，对患者进行静脉滴注，1次/d。用药时间为对患者进行化疗的第1天、第2天、第3天、第4天、第9天、第10天、第11天、第12天、第17天、第18天、第19天、第20天。5）治疗28天为1个周期，应连续治疗2个周期。

1.4 检测设备和试剂

1.4.1 检测设备 本次研究所用的检测设备主要包括：1）1.5 ml的微量离心管、2 ml的微量离心管、移液器和微量高速离心机（均由Eppendorf公司生产）。2）超净工作台（由苏州净化设备仪器厂生产）。3）37 ℃恒温箱（由福意联恒温箱公司生产）。4）550酶标仪（由Bio-rad公司生产）。5）COBAS INTEGRA 400 Plus型全自动生化分析仪（由Roche公司生产）。6）MDF-328E型低温冰箱（由日本三洋公司生产）。7）FACS Calibur型流式细胞仪（由美国Becton Dickinson公司生产）。

1.4.2 检测试剂 本次研究所用的检测试剂主要包括：1）CD3/CD4/CD8单克隆抗体、CD4/ CD25单克隆抗体、鼠抗人Foxp3型单克隆抗体、CD3单克隆抗体、CD8单克隆抗体、IL-17A单克隆抗体、同型对照IgG2a和同型对照IgG1（均由美国Becton Dickinson公司生产）。2）IL-6检测试剂盒和IL-17检测试剂盒（均由上海拜力生物科技有限公司生产）。3）TGF-β检测试剂盒（由上海富众生物科技发展有限公司生产）。

1.5 检测方法

1.5.1 进行Treg检测和Th17检测的方法 采用流式细胞技术对两组患者Treg、Th17的水平进行检测。进行Treg检测的方法是：1）取两支流式管，分别标记为测定管和同型对照管。2）在这两支流式管中均加入20μl的 CD4-FITC抗体。然后，将5μl的CD25-APC抗体加入到测定管中，并将等量的同型抗体加入到同型对照管中。3）在测定管和同型对照管中分别加入受检者的细胞悬液100μl，避光孵育30 min。孵育结束后，用PBS缓冲液对这两支流式管中的细胞悬液进行离心洗涤，然后弃去上清液。4）在这两支流式管中加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育结束后，用PBS缓冲液重悬细胞。5）将20μl的Foxp3-PE抗体加入到测定管中，并将等量的同型抗体加入到同型对照管中，避光孵育30 min。孵育结束后，用PBS缓冲液对细胞悬液进行离心洗涤，然后弃去上清液。6）使用0.3ml的PBS缓冲液重悬细胞，然后使用流式细胞仪对流式管中Treg的含量进行检测。进行TH17检测的方法是：1）取两支流式管，分别标记为测定管和同型对照管。2）在这两支流式管中均加入受检者的细胞悬液100μl。然后，将20μl的CD4抗体（FITC标记）和5 μl的CD3抗体（APC标记）加入到测定管中，将等量的同型抗体加入到同型对照管中，避光孵育30min。3）孵育结束后，用PBS缓冲液对这两支流式管中的细胞悬液进行离心洗涤。弃去上清液后，用PBS缓冲液重悬细胞，并对细胞悬液进行细胞染色。4）将染色后的细胞悬液加入到培养板中，按标准工作浓度依次加入佛波酯、离子霉素和含莫能霉素的Golgistop蛋白转运抑制剂，吹打混匀后将培养板置于细胞培养箱内培养5h。5）将培养后的细胞悬液重新置于测定管和同型对照管中，并在这两支流式管中均加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育结束后，使用PBS缓冲液对细胞悬液进行离心洗涤。弃去上清液后，使用PBS缓冲液重悬细胞。6）将20μl的IL-17-PE抗体加入到测定管中，并将等量的同型抗体加入到同型对照管中，避光孵育30 min。孵育结束后，用PBS缓冲液对细胞悬液进行离心洗涤，然后弃去上清液。7）使用0.3 ml的PBS缓冲液重悬细胞，然后使用流式细胞仪对流式管中TH17的含量进行检测。

1.5.2 进行IL-6、IL-17和TGF-β检测的方法 采用ELISA双抗体夹心法对两组患者IL-6、IL-17和TGF-β的水平进行检测（严格按照试剂盒操作说明书中规定的实验步骤进行实验操作）。

1.6 观察指标

观察并对比两组患者治疗的效果及治疗前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。

1.7 疗效评定标准

CR（完全缓解）：患者的肿瘤病灶消失。2）PR（部分缓解）：患者的肿瘤病灶缩小50%以上。3）MR（微效）：患者的肿瘤病灶缩小25%至50%。4）NC（稳定）：患者的肿瘤病灶缩小不足25%。5）PD（进展）：患者的肿瘤病灶未缩小，甚至在增大。

1.8 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对研究数据进行统计学处理，患者Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平用（±s）表示，采用t检验，治疗的总有效率用%表示，采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗效果的比较

硼替-地塞组患者中治疗效果为CR的患者有10例（占33.3%），为PR的患者有7例（占23.3%），为MR的患者有2例（占6.7%），为NC的患者有9例（占30.0%），为PD的患者有2例（占6.7%）。硼替-地塞组患者治疗的总有效率为93.3%（28/30）。VAD-沙利组患者中治疗效果为CR的患者有3例（占10.0%），为PR的患者有11例（占36.7%），为MR的患者有1例（占3.3%），为NC的患者有5例（占16.7%），为PD的患者有10例（占33.3%）。VAD-沙利组患者治疗的总有效率为66.7%（20/30）。与VAD-沙利组患者相比，硼替-地塞组患者治疗的总有效率更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2 治疗前后两组患者Treg、Th17水平的比较

在进行治疗前，两组患者Treg、Th17的水平相比差异无统计学意义（P＞0.05）。经过2个周期的化疗后，两组患者Treg的水平均较治疗前明显升高，其Th17的水平均较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与VAD-沙利组患者相比，硼替-地塞组患者Treg水平升高的幅度和Th17水平降低的幅度均更大，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

2.3 治疗前后两组患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比较

在进行治疗前，两组患者IL-6、IL-17和TGF-β水平相比差异无统计学意义（P＞0.05）。经过2个周期的化疗后，两组患者IL-6、IL-17和TGF-β水平均较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与VAD-沙利组患者相比，硼替-地塞组患者IL-6水平和IL-17水平降低的幅度均更大，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者TGF-β水平降低的幅度相比差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表1 两组患者治疗效果的比较

表2 治疗前后两组患者Treg、Th17水平的比较 （ %，±s）

表2 治疗前后两组患者Treg、Th17水平的比较 （ %，±s）

注：▲与治疗后比较，差异具有统计学意义，P＜0.05；△与VAD-沙利组比较，差异具有统计学意义，P＜0.05。

组别 例数 Treg的水平 Th17的水平治疗前 治疗后 治疗前 治疗后硼替-地塞组 30 3.48±1.20▲ 4.87±1.32△ 2.67±0.93▲ 1.73±0.91△VAD-沙利组 30 3.46±1.27▲ 4.35±1.22 2.64±0.97▲ 2.04±0.90

表3 治疗前后两组患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比较 （ ±s）

表3 治疗前后两组患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比较 （ ±s）

注：▲与硼替-地塞组比较，差异具有统计学意义，P＜0.05；△与治疗前比较，差异具有统计学意义，P＜0.05。

组别 例数 IL-6(pg/ml) IL-17(pg/ml) TGF-β(ng/ml)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治 疗前 治疗后硼替-地塞组 30 17.82±3.56 6.73±1.77△ 48.33±5.64 19.41±3.84△ 21.87±3.73 9.07±2.45△VAD-沙利组 30 17.14±3.48 8.15±1.90▲△ 48.25±5.57 23.27±3.91▲△ 21.29±3.84 8.83±2.75△

3 讨论

MM是一种血液系统恶性肿瘤。此病的发病机制十分复杂。有研究指出，MM的发生、发展与电离辐射、慢性抗原刺激、免疫功能紊乱、EB病毒或疱疹病毒感染诱发的C-MYC、N-RAS、K-RAS或H-RAS密切相关。

Treg是一种同时具有免疫无能和免疫抑制两大特性的T细胞亚群。临床研究发现，MM患者Treg的水平与其病情的严重程度密切相关[3]。Th17是一种以分泌IL-17为主要特征的T细胞亚群。Schmidmaier H等[4]在临床研究中应用流式细胞仪对MM患者外周血及骨髓中Th17的水平进行检测。研究结果显示，MM患者外周血及骨髓中Th17的水平均明显高于正常人。

IL-6是一种细胞因子，具有刺激初始CD4+T细胞向Th17分化的作用[5]。有研究指出，MM患者IL-6的水平明显高于正常人，且其IL-6的水平与其病情的严重程度密切相关[6]。Fulciniti M等[7]指出，IL-6是促进骨髓瘤细胞生长的关键因子。

IL-17是Th17的主要效应分子。2006年，Alexandrakis MG等[8]通过临床研究发现，MM患者IL-17的水平明显高于正常人，且其IL-17的水平与其病情的严重程度密切相关。TGF-β是一种具有调节细胞生长和分化作用的细胞因子[9]。研究发现，几乎所有的肿瘤细胞中都可以检测到TGF-β的mRNA[10]。

硼替佐米、地塞米松、长春新碱、表柔比星、地塞米松和沙利度胺均为临床上常用的抗肿瘤药物[11]。硼替佐米(bortezomib)属于氨基硼酸衍生物，其商品名为万珂。此药能够有效地抑制转录因子NF-κB、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)和IL-6的活性，降低骨髓基质细胞的粘附能力[12]。沙利度胺(Thalidomide)属于谷氨酸衍生物，其商品名为反应停。此药具有调节免疫细胞活性、抑制炎性细胞因子活性和诱导抗肿瘤免疫反应等作用，从而可有效地抑制骨髓瘤细胞的生长和增殖[13]。为了对比用VD方案（硼替佐米+地塞米松）与联合应用改良的VAD方案（长春新碱+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺治疗MM的临床效果，笔者将2011年6月至2013年12月期间张家港市中医医院肿瘤血液科收治的60例MM患者随机分为硼替-地塞组和VAD-沙利组。为硼替-地塞组患者采用VD方案进行化疗，为VAD-沙利组患者联合应用改良的VAD方案和沙利度胺进行化疗。治疗结束后，对比两组患者治疗的效果及治疗前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。本次研究的结果显示，硼替-地塞组患者治疗的总有效率高于VAD-沙利组患者，治疗后其Treg的水平高于VAD-沙利组，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，与联合应用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治疗MM的临床效果更好。

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R73

B

2095-7629-（2017）8-0064-04

宋丽丽，女，1983年12月出生，江苏张家港人，主治医师，硕士， 研究方向为血液疾病的诊断与治疗

＊通讯作者：潘迎英