鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度的SSR分子标记引物筛选

2017-12-01，，，，，，，，

种子 2017年6期

关键词：甘蓝型杂交种株数

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(1.汉中市农业科学研究所，陕西汉中 723000； 2.汉中市种子管理站，陕西汉中 723000)

·种子检验·

鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度的SSR分子标记引物筛选

薛艳1，李英1，张星1，王风敏1，諶国鹏1，习广清1，李虎1，胡宝华1，田晓舟2

(1.汉中市农业科学研究所，陕西汉中 723000； 2.汉中市种子管理站，陕西汉中 723000)

为了建立一套快速可靠的甘蓝型油菜杂交种纯度的鉴定方法，选择具有代表性的6份油菜品种(组合)，采用20对SSR甘蓝型油菜首选核心引物对供试材料进行引物筛选，并将筛选出的引物应用于杂交种的种子纯度鉴定。目前已为其中每个杂交种(组合)平均筛选出1～3对引物，经大田验证可用于杂交种的真假鉴定和纯度鉴定，应用前景十分广阔。

甘蓝型油菜；杂交种；种子纯度； SSR

油菜杂交种不但在产量性状上具有明显的杂种优势，而且其品质及抗性方面也较常规种具有显著的优势[1]。种子纯度是影响油菜杂交种质量的重要参数，直接影响杂交种在生产上的产量表现，因此在杂交种大面积推广前必须对种子纯度进行鉴定[2]。

传统油菜杂交种纯度的鉴定采用大田异地鉴定或同工酶和贮藏蛋白电泳技术。大田鉴定由于费时费工成本高，虽然结果可靠但很难在生产上推广，而同工酶和贮藏蛋白电泳技术鉴定谱带少，标记多态性相对较低，难以显示出不同品种基因型间的差异[3]。近年来，随着分子生物学的发展，各种分子标记技术大量应用到杂交种纯度的鉴定中，其中SSR(Simple Sequence Repeats)作为第二代基于PCR(Polymerase Chain Reaction)的一种新型DNA分子遗传标记，由于其数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，具有多等位基因的特性，提供的信息量高，以孟德尔方式遗传，在F1代呈共显性，更加适合种子纯度鉴定，而且实验操作简单，稳定性强、重复率高、成本低，已被广泛应用于大豆、玉米、水稻等种子纯度鉴定[4-6]。

表1 SSR引物序列Primer Sequence (5'3')

引物名称引物序列Na14⁃G10ACGAAGTGGGTTAGTAGGCGGAAGCCTTTCTCCACCATTGNa12⁃E02TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGGGCAGCCACAACCTTACGBRAS067AATTTAAACCTCATTTTCTTCACCTCCATTGTGTCTGATCB10027CGGCTTGTAAACCTTGGACTCGAAAATCACTAACACCB10028CTGCACATTTGAAATTGGTCAAATCAACGCTTACCCACTCB10036ATTCATCTCCTGCTCGCTTAGAAACCCAAACCAAAGTAAGAACB10057CTAGGCTAAGGAAGATTGTCATAGTTTCTTCCTCCTGCTATCCB10172ATTGGTCTCTTAACCCGCTTCTCGAATCCCTCGAACB10299TACAGGTTCCTTGCGATGATGGACGAGACAACATGGCB10330AGGCGAGTTTACGAGGATACCTGCACCAGTCATTTGCB10364GAGACGATGCAAAGATCGTGCAGACACATTCGAACACB10369CATTCACAGGACCAGAGCCAAAGCCAAGACAACCATCB10373CGGTCAGATTCCAACAGAGCCATCTCAGAGACGACACB10427TCCCAACAAAAGAGTCCACAGCGAACCGAGTCTAAACB10587TTGTGTTTTGCCTTCTGATTTGCGCACAAACAATAACN5CGTTGGCAAAAAGCCTACTCCTCAGGGACGTCGTAAGAGCCN22TTGCTTCCAGAGATCTGGTTCGCGACTACTAAATTGTCGTGTTCN48GCGATCTCCTCAGGCATAGTCCACGCAAGCTGAAACATAACN52CCGGCTTGGTTCGATACTTATTGCGAATCTTTAAGGGACGCN57CACACCCTTACCACGTTCCTGCAACAAAGCATACTTCGCA

1 材料和方法

1.1 材料

国审品种汉油8号和即将审定的油菜组合5份，均由汉中市农业科学研究所油菜研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取

每份材料用千粒板数120粒油菜种子，均匀播撒在铺有滤纸的培养皿中，待苗子培养7 d左右，取其叶片用SDS法提取DNA。

1.2.2PCR扩增20对SSR引物序列参照国家农业行业标准油菜品种鉴定DNA序列(附表1)[7]，MIX、引物均购于西安沃尔森公司。从20对SSR引物中筛选出具有多态性的引物加以利用，进一步设计多重PCR进行品种纯度鉴定。

PCR扩增按如下反应体系进行：Mix 7.5μL，DNA 2μL，Prime 1μL，ddH2O 4.5μL，总体系15.0μL。

采用降落PCR反应程序，按下列参数进行：

94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 10个循环，每循环退火温度降低0.5 ℃；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 PAGE胶电泳及染色

制胶：凝胶成分包括5×TBE、30%丙烯酰胺、ddH2O、10%过硫酸铵、TEMED凝固催化剂，电泳缓冲液为0.5×TBE。

PAGE电泳检测：在电泳槽上进行8%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电压150 V，电泳1.5 h。

显带：电泳完成后，用硝酸银染色显带，具体包括7个步骤：固定—水洗—染色—快速漂洗—显影—停显—漂洗—风干保存。

1.2.4引物的筛选

构建亲本DNA样品混合基因池：取母本的12个单株叶片，分别提取DNA后，等量混合构建一个基因池，同样的方法取父本12个单株叶片，等量混合构建另一个基因池。用亲本的这2个混合样品池进行SSR引物筛选，得到具有多态性的扩增引物[8]。

用上述步骤中亲本筛选到的多态性引物，扩增杂交种的混合基因池样品，进一步筛选得到可用于鉴定种子纯度的多态性SSR引物。

1.2.5数据处理与结果分析

SSR纯度(%)=(检测株数-母本带型数-父本带型数)×100/检测株数。

田间鉴定：将试验中所用同批次杂交种进行大田种植，在供试材料发育至盛花期时，根据育性表现进行调查，田间鉴定纯度(%)=(检测株数-不育株数-异型株数)×100/检测株数。

2 结果与分析

2.1 引物的筛选结果

本试验用20对油菜首选核心引物为6对杂交种(组合)筛选引物，目前已为每个杂交组合平均筛选出1～3对双亲互补型引物(父母本的特征条带在杂种中同时出现)，经验证可用于杂交种的真假鉴定和纯度鉴定(见表2)。

2.2 杂交种纯度的SSR鉴定

为了验证SSR标记对参试杂交种(组合)纯度鉴定结果的可靠性，用筛好的引物Na 12-E 02将汉11 C 20的纯度进行了SSR鉴定(图1)，鉴定结果显示其纯度为92%，与田间鉴定结果94%非常接近，SSR鉴定结果与田间鉴定结果基本一致。从总体结果来看，田间鉴定和室内鉴定2种方法的结果相关系数均在0.95以上，表明这2种鉴定方法有很高的相关性。

表2 种子纯度鉴定SSR引物筛选结果

汉11C20Z11×D⁃5汉11C29汉油7号汉1418汉油8号Na12⁃E02CB10330CB10369CB10369CB10330CB10026CN48Na12⁃E02CN52CN57CB10373CB10028CB10373CB10028

表3 田间种植鉴定和SSR标记鉴定的纯度结果

品种(组合)田间鉴定株数不育株数异型株数田间鉴定纯度(%)母本带型株数父本带型株数SSR鉴定纯度(%)2种方法相关系数汉11C2019810094．98091．80．97Z11×D⁃51987196．06095．00．99汉11C2919811094．47292．50．98汉油7号19812292．910190．80．98汉14181989095．58093．30．98汉油8号19814291．915087．50．95

3 结论与讨论

通过对本试验中油菜杂交种的室内分子鉴定和田间种植鉴定2种结果进行比较分析，认为在对种子进行纯度鉴定时，这2种方法得出的结果基本一致，可以用SSR标记鉴定来代替田间纯度鉴定，从而克服田间鉴定周期长、易受外界环境条件影响等缺点。而室内鉴定的纯度基本都低于大田鉴定纯度，这是因为种植鉴定主要根据品种表现和生物学性状进行判定，检测结果受检测人员经验水平和样品亲本的遗传差异度影响。而应用SSR分子标记进行种子纯度鉴定时，揭示的是种子基因组DNA序列的多态性，因此，结果的准确性更高。而对油菜杂交种纯度进行鉴定时所选用的SSR引物越多，提供的信息量越大，其结果的可靠性也越高，但其开发成本也相对较高。在实际生产中，油菜杂交种的假杂种主要来源于制种过程中的母本自交系，因此只要选用一对或者2对合适的共显性SSR引物鉴别亲本类种子，就可以达到杂交种纯度鉴定的目的。

注：1～20为汉11 C 20杂交种； M为DNA marker；P 1为母本；P 2～P 3为父本。图1 SSR引物Na 12-E 02在汉11 C 20群体中的验证

在应用SSR技术鉴定种子纯度时，多态性引物的筛选是整个实验的核心，一般会遇到4种引物类型：杂交F1代和父母本无任何多态性、偏父型、偏母型、双亲互补型。偏父型引物可以检测出掺杂父本自交系的种子，偏母型引物可以检测出掺杂人工去雄不彻底的种子，双亲互补型引物则可以把三者都区分出来，而决定某一引物是否适合用来进行鉴定的关键在于父母本的特征条带能否在杂种中同时出现[9]。随着作物选育品种数目的增多及育种材料遗传基础的日益狭窄，品种间的遗传差异越来越小，传统的生物学性状鉴定方法已经难以满足品种真实性和纯度鉴定的要求。分子生物学的发展和分子标记的应用，能够克服大田鉴定费时费工及鉴定结果滞后等缺点，在杂交种纯度鉴定中的应用前景将十分广阔[10]。

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Screening of SSR Primers for Identification the Seed Purity ofHybridBrassicanapus

XUEYan1，LIYing1，ZHANGXing1，WANGFengmin1，CHENGuopeng1，XIGuangqing1，LIHu1，HUBaohua1，TIANXiaozhou2