氢氧化钠和双氧水预处理高丹草秸秆条件的优化研究

张鸭关，陈自宏，赵红艳，汪 帆*,徐 玲

(1.曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011；2.保山学院高黎贡山生物资源研究所，云南 保山 678000)

氢氧化钠和双氧水预处理高丹草秸秆条件的优化研究

张鸭关1，陈自宏2，赵红艳1，汪 帆1*,徐 玲2

(1.曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011；2.保山学院高黎贡山生物资源研究所，云南 保山 678000)

【目的】预处理是利用生物质原料制备燃料乙醇的工艺过程中至关重要的一步，文章以高丹草秸秆为主要研究对象，对氢氧化钠和双氧水预处理高丹草秸秆优化工艺进行了研究。【方法】本研究在研究预处理的氢氧化钠浓度、时间、固液比和双氧水浓度4个单因素对预处理效果影响的基础上，采用正交试验对碱和双氧水预处理高丹草秸秆工艺进行优化。【结果】碱和双氧水最佳预处理工艺条件为水解时间为72 h、氢氧化钠浓度为3 %、双氧水浓度为1 %、固液质量比为1∶10，在此条件下，高丹草木质素去除率为77.09 %。

高丹草；氢氧化钠和双氧水；预处理；木质素去除率

【研究意义】近些年来，化石燃料日益枯竭从而引发能源严重短缺，大气环境污染日益严重，因此，清洁生物质能源利用技术的研究已显得迫在眉睫[1]。【前人研究进展】木质纤维素类物质是世界上最广泛的可利用的生物材料，这些廉价的原料有木材及其加工废弃物、农作物秸秆、城市垃圾及快速生长的草[2]。其中，牧草是极易种植，且生产力极高的一种木质纤维素类物质，尤其是能源牧草，在短时间内即可获取较大生物产量，与传统土地利用方式—牧场或农耕地等相比，具有更高的经济和生态价值[3]。【本研究切入点】传统农作物高粱(Sorghumbicolor)具有耐旱、耐盐碱、耐涝的优点，而牧草苏丹草(S.sudanense)具有茎叶柔软，适应性、抗旱性强和再生性好的优点[4-8]，二者的生物学特性差异较大，并且无生殖隔离，杂种优势强。高丹草(Sorghum-SudanGrassHybrid)是根据杂种优势原理，用高粱和苏丹草杂交而成的优良牧草，其结合了高粱叶宽、茎粗和苏丹草分蘖力、再生力强的优点，杂种优势非常明显，再生性好、产量高(北方一年可刈割3～4次，一般产鲜草4.5～7.5万kg/hm2，南方一年可刈割6～8次，最高产鲜草19.5万kg/hm2左右[7-8])、含糖量较高、耐贫瘠及抗逆性强等优点[7-8]，是一种很好的低成本的木质纤维素生物质原料，适于作为能源牧草，用来生产清洁燃料乙醇。

表1 高丹草秸秆的成分分析

表2 氢氧化钠和双氧水预处理高丹草水平设置

【拟解决的关键问题】木质纤维素类物质主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，其质量约占植物总质量的80 %～95 %[9-15]。其中，在纤维素酶催化下，纤维素和半纤维素被水解为还原糖，通过酵母菌发酵，还原糖又可转化生成清洁生物质能—乙醇。但是，在纤维素酶催化纤维素水解时，因为纤维素是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而形成的高分子有机化合物，同时被木质素和半纤维素包裹，从而使纤维素形成致密不透水的高级结构，导致纤维素酶难于与纤维素直接接触，严重影响后面的水解和发酵过程[9-15]。因此，木质纤维素类物质预处理的主要目的是除去木质素和部分半纤维素，从而破坏纤维素致密不透水的高级结构，提高酶水解时纤维素转化率以及发酵时的效率[9-15]。鉴以此，本研究主要用稀氢氧化钠和双氧水对能源牧草—高丹草秸秆进行预处理工艺的研究，同时考察预处理时间、氢氧化钠和双氧水浓度、固液比等因素对高丹草秸秆预处理工艺效果的影响，以期为高丹草秸秆生产乙醇的清洁生物质能源利用技术研究提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

高丹草采自云南省肉牛和牧草研究中心实验基地。将样品自然风干，然后将其在105 ℃条件下恒温10 h，粉碎，过40目筛，贮存在干燥器中备用。经测定，高丹草秸秆的主要组分及热值见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 在30 ℃下，考察预处理时间、氢氧化钠和双氧水浓度、固液比等因素对高丹草秸秆预处理工艺效果的影响，即研究在不同条件下，预处理前后高丹草主要成分纤维素、半纤维素和木质素含量的变化趋势。预处理试验初始条件设定为时间72 h、碱和双氧水浓度分别为2 %和1 %、固液质量比为1∶10，按表2设置的预处理试验水平进行单因素试验。

1.2.2 正交试验 在单因素试验中，找到了预处理时间、碱和双氧水浓度、固液比4种因素合适的变化范围，为了研究各因素的主效应和因素之间的交互作用，得出最佳预处理条件，进行了L9(34)的正交试验设计。

1.3 评价指标及测定方法

1.3.1 纤维素、半纤维素、木质素含量分析 采用范氏法(Van Soest)测定高丹草秸秆中纤维素、半纤维素和木质素质量分数，本实验中测得的纤维素、半纤维素和木质素含量均为相对含量。

1.3.2 还原糖、糠醛的测定 (1)还原糖含量测定采用DNS(3,5-二硝基水杨酸比色法)。

式中：C为水解液中的糠醛浓度，μg/mL；V为水解液体积，mL；m为预处理高丹草的干物质量，g。

1.3.3 扫描电镜分析 为了更进一步的了解氢氧化钠氧化预处理方法对高丹草秸秆的预处理效果，利用超高分辨热场发射扫描电子显微镜在 5000及 8000倍下观察高丹草秸秆预处理前后细胞壁表面结构的变化。

2 结果与分析

2.1 高丹草秸秆预处理单因素试验

2.1.1 氢氧化钠和双氧水及其交互作用对预处理效果的影响 在温度为30 ℃，固液比为1∶10的条件下，分别用2.0 %的氢氧化钠和1.0 %的双氧水及两者的混合夜处理高丹草72 h，探究氢氧化钠与双氧水对高丹草的相互作用。

由图1可知：单独用NaOH预处理时,高丹草秸秆中纤维素相对含量由30 %增加至45 %，半纤维素相对含量由25.19 %增加至26.5 %，木质素相对含量由15.28 %减少到10.1 %，由此可知，高丹草秸秆中部分木质素被除去，而纤维素和半纤维素被大量保留；而单独用H2O2预处理时,木质素相对含量减少至13.1 %，可见，单独用H2O2预处理时，仅能除去极少量的木质素；当两者配合使用时，纤维素相对含量增加至49.2 %，木质素含量减少到8.9 %，可见，氢氧化钠和双氧水混合使用时，溶解木质素的能力得到很大程度的提高，这可能是因为碱性环境会使 H2O2产生过氧根离子,过氧根离子对亲电子中心具有更高的反应活性,可以更有效的氧化溶解木质素，而且在弱碱性介质中H2O2只会与木质素降解产生的酚类化合物发生作用,导致它的降解,但是不会改变纤维素的成分，所以试验中采用NaOH和H2O2的混合溶液来进行高丹草预处理。

2.1.2 预处理时间对预处理高丹草效果的影响 在30 ℃，2 %NaOH，1 %H2O2和固液比1∶10的条件下，分别浸泡12，24，48，72，96 h进行预处理，来考察时间对高丹草预处理效果的影响。由图2可以看出：预处理时间对半纤维素的影响很小，但是对纤维素和木质素的影响很大，随着预处理时间的增加，高丹草中纤维素的相对含量逐渐增加，而木质素相对含量逐渐降低。其中，在预处理时间为48，72，96 h时，纤维素相对含量增幅最大，木质素含量急剧降低，预处理96 h后，高丹草中各组分相对含量趋于平稳。因此，正交试验的时间可选48，72，96 h 3个水平。

图1 氢氧化钠和双氧水及其交互作用对预处理效果的影响Fig.1 The effect of sodium hydroxide, hydrogen peroxide and their interaction on pretreatment results

图2 预处理时间对高丹草各组分含量的影响Fig.2 The effect of different pretreatment time on the component of Sorghum-Sudan Grass Hybrid straw

2.1.3 预处理固液比对预处理高丹草效果的影响 在30 ℃下，分别按1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25固液比加入2 %的NaOH和1 %H2O2，预处理时间为72 h的条件下，来考查固液比对高丹草预处理效果的影响。由图3可以看出，固液比对高丹草中半纤维素的相对含量影响较小，而对纤维素和木质素影响较大。固液比从1∶5到1∶15时，高丹草中纤维素相对含量迅速增加，木质素相对含量迅速降低，1∶15以后，随着固液质量比的增加，各组成成分相对含量的变化较小。因此，可以选择固液比1∶5、1∶10、1∶15等3个水平进行正交实验。

2.1.4 预处理氢氧化钠浓度对高丹草预处理效果的影响 在预处理温度为30 ℃，时间为72 h，固液比为1∶10的条件下，在1 %的双氧水溶液中分别加入1 %,2 %,3 %和4 %浓度的氢氧化钠预处理，来研究氢氧化钠浓度对高丹草预处理效果的影响。由图4可知，随着预处理氢氧化钠浓度的不断增大，高丹草中半纤维素相对含量变化较小，纤维素相对含量急剧增加，木质素相对含量急剧下降，其中，在氢氧化钠浓度在0～1 %，1 %～2 %和2 %～3 %，高丹草纤维素和木质素的变化幅度较大，3 %之后，趋于平稳。因此，可以选择预处理氢氧化钠浓度为1 %、2 %、3 %等3个水平进行正交实验。

图4 预处理氢氧化钠浓度对高丹草各组分含量的影响Fig.4 The effect of concentration of sodium hydroxide on the component tent of Sorghum-Sudan Grass Hybrid

2.1.5 预处理双氧水浓度对高丹草预处理效果的影响 在预处理温度为30 ℃，时间为72 h，固液比为1∶10的条件下，在2 %的氢氧化钠溶液中分别加入1 %，2 %，3 %和4 %浓度的双氧水预处理，研究双氧水浓度对高丹草预处理效果的影响。由图5可知，在双氧水浓度为0～1 %的范围内，随着双氧水浓度的增加，高丹草中纤维素的相对含量急剧增加，木质素相对含量急速下降，但是，双氧水浓度1 %以后，随着浓度的增加，高丹草各组分相对含量的变化很小，最后趋于平稳，可见，在较低的双氧水浓度下就可以把木质素大部分溶解，这样不仅降低了预处理成本，还可以减少后续发酵时剩余双氧水的处理费用。因此，可以选择预处理双氧水浓度为1 %，2 %，3 %等3个水平进行正交实验。

2.1.6 高丹草预处理工艺条件优化 为了寻找高丹草秸秆预处理的最优工艺，在考察了预处理单因素对预处理效果影响的前提下，以木质素去除率为考察指标，进行了L9(34)的正交试验设计，因素水平设计见表3，试验结果见表4。由表4可知，最佳预处理条件为C3B2A2D1，即预处理时间为72h、固液比为1∶10、氢氧化钠浓度为3 %、过氧化氢浓度为1 %；对高丹草预处理效果影响最大的因素是氢氧化钠浓度，然后是固液比和预处理时间，影响最小的是双氧水浓度。

图5 双氧水浓度对高丹草各组分的影响Fig.5 The effect of concentration of H2O2 of the component tent of Sorghum-Sudan Grass Hybrid

2.1.7 高丹草秸秆正交优化预处理的组分分析 在正交优化后的最佳预处理条件下，预处理高丹草秸秆，并对预处理后水解液中的还原糖及残渣进行分析，结果如表5所示，从表5中可知，预处理水解液中还原糖浓度为6.80 %，糠醛浓度为0.05 %，同时残渣中纤维素的相对含量由预处理前的30 %提高至65.32 %，半纤维素由25.19 %提高至至28.96 %，木质素由15.28 %降至3.50 %，木质素的去除率为77.09 %。由此可见，在优化后的最佳预处理条件下预处理高丹草秸秆，其木质素溶解比较显著，半纤维素也有一些水解，而纤维素的水解程度却很低，不仅有效地打破了纤维素致密的结晶结构，还完好地保留了高丹草秸秆中的纤维素成分，同时，水解液中糠醛浓度还很小，为后续的酶解糖化过程奠定了坚实的基础。

2.2 高丹草秸秆在预处理条件下前后表面结构的变化

由图6可知，高丹草未经预处理的秸秆表面结构光滑平整，致密，呈平行排列的纤维束状。而经过氢氧化钠/双氧水最佳预处理条件预处理后的高丹草秸秆，致密结构已经被破坏，表面结构粗糙，变得疏松，纤维出现很多断裂，多孔隙。说明预处理破坏了高丹草秸秆原有的致密节结晶结构，使其比表面积增大。有利于后续酶解过程中酶与纤维素、半纤维素成分的结合。

表3 氢氧化钠氧化法因素水平设置

表4 正交试验结果

表5 预处理水解液及残渣主要成分

3 讨 论

木质纤维素类物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成其中，在纤维素酶催化下，纤维素和半纤维素可被水解为还原糖，通过酵母菌发酵，还原糖又可生物转化生成清洁生物质能—乙醇[9-15]。但是纤维素是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而形成的有机高分子化合物，并且被共价结合的木质素和半纤维素包覆，使得纤维素形成致密的高级结构，使纤维素酶难与纤维素接触，直接影响木质纤维素的b;和发酵过程[9-15]。木质纤维素原料预处理的主要作用是去除木质素和部分半纤维素，打破纤维素的晶体结构，提高酶水解过程中纤维素转化率以及发酵过程的效率[9-15]。因此，预处理是利用生物质原料制备燃料乙醇的工艺过程中至关重要的一步。本研究在分析各单因素条件对氢氧化钠/双氧水预处理高丹草秸秆原料物理化学变化过程的基础上，以木质素去除率为参数，通过正交试验优化得到氢氧化钠双氧水预处理高丹草秸秆的最佳预处理条件为∶预处理时间为72 h、固液比为1∶10、氢氧化钠浓度为3 %、双氧水浓度为1 %。在此条件下，氢氧化钠性H2O2预处理后，高丹草木质素的去除率为77.09 %，同时残渣中纤维素的相对含量由预处理前的30 %提高至65.32 %。这可能是氢氧化钠和双氧水混合使用，溶解木质素的能力得到很大程度的提高，使高丹草秸秆表面结构变得疏松，纤维出现很多断裂和孔隙，比表面积增大，实现对高丹草秸秆的高效预处理，利于后续酶解中酶与纤维素成分的有效结合，对后续燃料乙醇发酵生产具有重要意义[14-15]。

4 结 论

①氢氧化钠和双氧水混合使用时，溶解木质素的能力得到很大程度的提高，但是不会改变纤维素的成分；②双氧水浓度为1 %的碱溶液就可以把木质素大部分溶解。因此，在较低的双氧水浓度下就可以把木质素大部分溶解，不仅降低了预处理成本，还减少了后续发酵过程中剩余双氧水的处理费用；③用氢氧化钠和H2O2预处理高丹草秸秆的最佳预处理工艺为：预处理时间72h、固液比为1∶10、氢氧化钠浓度为3 %、双氧水浓度为1 %，高丹草秸秆木质素去除率为77.09 %；④用氢氧化钠和H2O2预处理高丹草秸秆时，对高丹草预处理效果影响最大的因素是氢氧化钠浓度，其次是固液比和预处理时间，影响最小的是双氧水浓度。

图6 高丹草秸秆表面结构扫描电镜图Fig.6 SEM pictures of surface structure

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(责任编辑 王家银)

OptimizationStudyonPretreatmentofSorghum-SudanGrassHybridStrawbyAlkalineandHydrogenPeroxide

ZHANG Ya-guan1, CHEN Zi-hong2, ZHAO Hong-yan1, WANG Fan1*, XU Ling2

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Qujing Normal University,Yunnan Qujing 655011,China ; 2.Institute of Biological Resources of Gaoligong Mountains, Baoshan University, Yunnan Baoshan 678000 , China)

【Objective】 Pretreatment was a key step in fuel-ethanol production from lignocellulose biomass. Optimization on alkaline and hydrogen peroxide pretreatment ofSorghum-SudanGrassHybridstraw was studied in this paper. 【Method】On the basis of assay of four pretreatment factors including pretreatment time, concentration of alkaline and H2O2，ratio of solid to liquid. Orthogonal experiments were used to obtain the optimal parameters.【Conclusion】 The experimental result indicated that the optimal parameters of pretreatment was 72 hours,3 % sodium hydroxide, 1 %H2O2,ratio of solid to liquid (1∶10). Under this condition, the lignin removal rate was 77.09 %.

Sorghum-SudanGrassHybrid; Alkaline and Hydrogen Peroxide; Pretreatment; Lignin removal rate

S543.9

A

1001-4829(2017)11-2512-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.020

2016-08-17

国家自然科学地区基金项目 (31460153)；云南省教育厅项目(2011C017)；曲靖师范学院青年项目(2010QN001)；2016年国家大学生创新创业训练项目(2073010007)

张鸭关(1978-)，女，副教授，从事生物资源的开发与利用研究,E-mail: zhangyaguan2013@163.com,*为通讯作者：汪 帆，E-mail:1936382716@qq.com。