元江野生稻柱头特异性启动子p51408的克隆及功能分析

周国华

(1.宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000；2.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

元江野生稻柱头特异性启动子p51408的克隆及功能分析

周国华1,2

(1.宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000；2.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

【目的】水稻柱头是水稻有性生殖的重要器官，柱头外露是决定异交结实的重要特性，是影响杂交水稻制种和不育亲本繁育的关键因素之一，开展水稻柱头外露特异表达启动子研究是探寻水稻杂种优势分子机理及进行分子育种的基础。【方法】对一个元江野生稻柱头外露特异表达基因的启动子p51048进行了克隆，分析了该启动子的序列结构特征及os51408的表达特性，通过构建该启动子的GUS融合表达载体，获得了转化体。【结果】组化染色分析表明，该启动子能在水稻花器官的柱头、花柱等区域特异表达，而在根、茎叶、颖花中无表达或低表达。【结论】推测其为柱头组织特异性启动子，将为进一步开展水稻柱头外露这一重要性状的分子机理和表达调控研究奠定基础。

水稻；柱头外露；启动子；克隆

【研究意义】水稻是中国最主要的粮食作物[1]。自20世纪70年代杂交水稻的研究推广，极大地提高了中国水稻产量，其繁育体系很大程度上依赖于以柱头外露为主的不育系异交特性的改良。柱头是参与水稻有性生殖过程中最重要的器官之一，柱头外露是指水稻开花时柱头伸到张开的颖壳之外，开花结束后颖壳闭合，但柱头仍留在颖壳外的特性，在决定不育系可交配特性、异交结实率及杂交制种产量等雌性花器性状中，柱头的外露率是最直接、最重要的因素之一[2-3]，对水稻柱头外露性状的深入研究意义重大。【前人研究进展】随着现代分子技术和遗传连锁图谱的应用，有关水稻柱头外露性状QTL基因定位的研究也有很多报道，共检测到与柱头外露率相关的QTLs 多达40余个[4-6]，尽管目前QTLs定位分析的报告很多，但其研究结果并不完全一致，这也反应出柱头外露性状QTL遗传的复杂性。关于柱头外露的基因功能、分子机制的研究仍然还没有很好的开展起来。野生稻比栽培稻具有更高的柱头外露率，而相对于野生稻，属于自花授粉的栽培稻柱头外露率一般较少，且雌雄蕊也较小[7]。Virmani和Athwal[8]分析比较了29个栽培稻品种和野生稻类型的柱头外露率，发现柱头外露率最低的是籼稻品种台中本地1号，最高的是野生稻。庞汉华[9]、范树国[10]等都在野生稻中发现大量高柱头外露率的类型，许多野生稻柱头外露率甚至达到100 %。从野生稻中发掘在栽培稻中已丢失或削弱了的优异基因已经成为当前杂交稻育种与水稻资源研究的热点[11]。【本研究切入点】元江野生稻分布在云南省红河州元江县，位于红河水系上游，是中国迄今发现的分布海拔最高(海拔780 m)的普通野生稻，雌蕊呈羽毛状，柱头紫色，外露率达100 %[12]，是研究水稻柱头外露性状的优异材料。本实验在以往研究及综合前人研究的基础上[13-14]，采用Li[13]及Swanson[14]方法于开花前1 d取样，对部分检测的基因进行实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测，发现探针号为OS51408.1.S1_at在柱头外露组织中特异表达，为进一步研究其表达调控特征和功能。【拟解决关键问题】本研究克隆了元江野生稻该基因上游1.8 kb启动子区，分析其序列结构特征，构建了相应的GUS表达载体，以进一步分析其表达调控特征，为更深入地研究水稻柱头外露性状的组织特异性启动子奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料来自元江野生稻的苗期嫩绿叶片，Trizol植物组织总RNA提取试剂盒自Invitrogen公司购买，EX-Taq、First strand cDNA Synthesis kit、转化质粒载体、DNA连接酶等采购自TaKaRa公司，感受态细胞、DNA marker、Taq酶等实验试剂购买自上海生工；琼脂糖回收试剂盒购买自大连宝生生物公司。所需扩增引物由上海生工合成。转化材料于2015年5月种植于宜春学院水稻实验基地。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

分别对元江野生稻不同时期、不同组织进行取样，按试剂盒说明提取总RNA后，电泳检测其质量，合格后经DNaseⅠ处理，按照First stand cDNA Synthesis试剂盒程序进行第一链cDNA的合成。

1.3 生物信息学功能分析

通过基因芯片数据分析，在OS51408基因编码上游1800 pb以内，利用启动子功能预测与分析开放软件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)及PlantCARE(http://bioinformatcs.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),查找该区域内的CAAT与TATA框等重要的自动自序列特征，进行该启动子功能预测，并分析其中的各顺式作用元件。

1.4 OS51408在不同组织中的表达量分析

根据OS51408基因组序列，以Actin为内参基因，设计荧光定量PCR引物：OS51408-F:5’- ACGCGTTTTTCCTGAACTGC -3’;OS51408-R:5’- CGACGACAGGGGCTTAACAA-3’;OsActinA:5’-CTTCATA GGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’;OsActinB:5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’。

分别提取元江野生稻不同生长阶段的幼苗、根、幼叶、花药、柱头、子房等组织的总RNA，反转录后以cDNA为模板，荧光定量PCR仪(ABI 7300)分析OS51408基因的时空表达特征，20 μl反应体系为：cDNA模板1 μl、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl、SYBR Premix Ex-Taq10 μl、ROX Reference Dye(50×)0.4 μl、 ddH2O 8.6 μl。反应程序设置：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，36个循环，添加绘制溶解曲线。每个样品实验重复3次，选取其中一次结果来做统计分析，运用2-△△T法计算该基因在不同组织中的相对表达量。

1.5 启动子序列分析与克隆

根据预测结果，利用Primer6.0软件(http://www.premierbiosoft.com)设计特异性引物(P51408-F：5’-ACC AGC GTC GAC CCT ATT GAG GGC GTT CCG AT-3’，P51408-R：5’-CAC CAG CGC CAT GG GTA GGC AGG ACC AGA GGA GA-3’),并设计载体构建所需的限制性内切酶SalΙ和NcoΙ识别位点(划线部分)以元江野生稻基因组DNA为模板，用高保真DNATaq酶PCR扩增该启动子序列。20 μl反应体系包括：PCR缓冲液Buffer4 μl，dNTP1.64 μl，上下游引物各0.5 μl，元江野生稻基因组DNA模板1 μl，DNA聚合酶0.2 μl，ddH2O至20 μl。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min， 56 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，循环30 次; 最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在2 %琼脂糖凝胶电泳下分离检测，回收试剂盒纯化目标片段。

1.6 载体构建与转化

用限制性内切酶SalΙ和NcoΙ分别双酶切上述回收纯化的PCR扩增产物和CAMBIA1305.1表达载体，琼脂糖凝胶电泳分离、回收、纯化p51408启动子序列和去除组成型启动子35S序列的表达载体片段，用T4-DNA连接酶(TaKaRa，大连)连接，构建pCAMBIA1305:p51408:GUS启动子报告基因表达载体(图1)，电击法转化大肠杆菌DH105B菌株的感受态细胞，经卡那霉素抗性培养基上筛选后扩大培养，菌液PCR和双酶切后送上海生工测序验证。

图1 表达载体pCAMBIA1305.1-p51408-GUS结构Fig.1 The structure of expression vector pCAMBIA1305.1-p51408-GUS

用构建好、测序正确的农杆菌菌株侵染受体ZH11幼胚诱导的愈伤组织。水稻愈伤组织培养、农杆菌介导的遗传转化以及阳性愈伤组织的筛选与再分化、抗性植株再生等操作依照粳稻遗传转化手册[7]。

1.7 GUS染色检测

将阳性转化植株叶片、花瓣、根茎等组织剪成小片，放于1.5 mL离心管中，加入预冷的90 %丙酮完全覆盖材料，常温处理20～30 min。以预固定组织并去除部分叶绿素。用蒸馏水将材料漂洗干净后置于1.5 mL离心管中；加入适量配制好的GUS染色工作液至完全覆盖材料，锡箔纸包好常温过夜放置。用25 %，50 %，70 %，95 %乙醇梯度洗脱，摇床轻摇每次20 min，光学显微镜下观察、拍照，白色背景下的蓝色染色区即为GUS表达位点。

2 结果与分析

2.1 Os51408基因的表达模式

为检验OS51408.1.S1_at的表达特征，对该启动子的调控基因OS51408在高柱头外露的元江野生稻各组织中的表达情况进行了分析，从图2可以看出，OS51408 基因在幼苗、根、幼叶、花药、子房中表达都很低，而在外露柱头组织中表达急剧升高，与前人水稻表达谱芯片数据库研究结果相吻合 (http://plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy/)[13]。说明p51408启动子与元江野生稻的柱头外露性状紧密相关，是柱头外露特异性表达启动子。

图2 Os.51408.1.S1_at在水稻不同组织的表达值Fig.2 The expression values of Os.51408.1.S1_at in different organism of rice

2.2 转化载体的构建及植株的获得

为验证该启动子的功能，本实验用带有酶切位点的特异引物从元江野生稻中扩增得到p51408启动子区(图3)，然后用SalI和NocI双酶切扩增片段，纯化后与经同样酶切的pCAMBIA1305.1连接，构建了pCAMBIA1305:p51408: GUS 融合基因的表达载体并双酶切验证(图1，图4)，p51408启动子约为1．8 kb。按照粳稻遗传转化的方法，以中花11为受体，用潮霉素筛选抗性愈伤组织，经分化、脱分化共得到阳性转化植株52棵。

图3 P51408目标片段扩增Fig.3 The amplification of target fragment of P51408

图4 载体p51408:GUS表达载体的酶切检验Fig.4 The enzyme-cutting test of the vector of p51408:GUS

2.3 P51408启动子的结构特征

启动子分析网站在线软件Softberry(www.softberry.com/berry.phtml)进行分析，结果表明，OS51408

基因上游1.8 kb左右序列为该基因启动子区。使用PLACE Signal Scan Program(http://www.dna.affrc.go.jp /PLACE)软件及PlantCARE(http://bioinformatcs.psb.ugent.be /webtools/plantcare/html/)软件分析该启动子序列，结果如图5所示，在-50-55和-715-720位置(翻译起始密码子ATG中的A碱基位定义为+1)各有1个TATA box，在初始密码子上游-24、-533、-545位置分别存在1个CAAT box，在-38处的G碱基位置为可能的转录起始位点。

经进一步的结构和功能域分析后，还在p51408启动子序列中发现在受植物激素(auxin)及水杨酸(salicylic acid)调控转录活性的CREB调控因子结合位点ASFI[15]，多个受光及植物激素调控的顺式作用元件G-box[16]，3个在参与赤霉素信号传导起重要作用的WRKY71OS 的结合位点[17],6个脱落酸响应的顺式作用位点，它们多是应答干旱和寒冷胁迫信号的MYB、MYC 蛋白因子专化识别的保守序列[18-19]；及植物组织特异表达和激素诱导rolB基因结合位点NTBBF1元件[20]。

图5 p51408启动子系列部分应答元件Fig.5 The reply elements of p51408

A:柱头，B：根，C：茎，D：叶，E：颖花A: Stigma，B：Root，C：Stem，D：Leaf，E：Spikelet图6 不同组织的GUS染色结果Fig.6 The stained results of GUS in different organism

2.4 转化植株的GUS表达检测

从图6可以看出，利用GUS进行组化染色，对52株水稻转化植株的各组织表达情况进行分析，结果表明，在转化植株中p51408启动子能够驱动GUS在水稻柱头组织中特异表达，检测到较强的表达信号(图6A)，而在根、茎，叶及幼穗中无表达或低表达(图6 B，C，D，E)，从而推测该启动子为柱头组织特异性启动子。

3 讨 论

植物组织特异性启动子的研究已成为近年来分子生物学、植物功能基因和基因工程研究的一个重要方向，也将成为植物基因改良的重要工具[21-22]。柱头外露是水稻异交结实中一个非常重要的性状，目前的研究主要集中在栽培措施的调控、性状的QTL定位上，而柱头外露的基因功能、分子生物学的机理及其相关基因功能研究并未系统地开展[6]。尽管很多研究人员在水稻柱头外露性状QTL基因定位的研究方面已有很多报道，共检测到与柱头外露率相关的QTLs 多达40余个[4-6]，但其研究结果并不完全一致，这也反应出柱头外露性状QTL遗传的复杂性。而通过特异性的材料，从启动子的功能和表达特性这个独特的角度对这一复杂性状进行研究，将为该性状的研究提供另一种思路和有益的探索。

4 结 论

本研究利用元江野生稻柱头外露高的这一特殊特点，克隆了具有柱头组织特异性并与其调控密切相关的启动子p51408。运用生物信息学手段对其结构进行了预测，揭示其包含多个受植物激素、光照诱导及组织器官特异性应答元件，如ASFI、G-box、WRKY71OS、NTBBF1等，从另一方面也说明了柱头外露的外源激素调控的分子基础；表达模式分析显示对其调控基因OS51408在幼苗、根、幼叶、花药、子房中表达较低，而在柱头中表达量高，表明其具有组织特异表达特性；构建载体GUS转化染色显示其在花柱及柱头特异表达，在根、茎、叶及颖花中低或者不表达，表明p51408具有较强的柱头组织特异表达特性，将有助于进一步开展与该性状相关的启动子调控的研究，并为开展水稻柱头外露性状的分子机理和调控研究奠定基础。

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(责任编辑 王家银)

CloningandFunctionalAnalysisofSpecificPromoterp51408inStigmaExsertionofWildRice(OryzarufipoganGriff.)fromYuanjiangCity

ZHOU Guo-hua1,2

(1.College of Life Sciences and Environment Resource, Yichun University, Jiangxi Yichun 336000，China; 2.College of Agronomy and Bio-technology, Yunan Agricultural Universty, Yunnan Kunming 650201，China)

【Objective】The stigma exsertion of rice(OryzasativaL.) was an important trait determining the outcrossing rates, which was also a key factor influencing the hybrid seed production and sterile line breeding, so the research of tissue-specific expression of stigma exsertion of rice would laid the foundation of the molecular mechanism in heterosis of rice. 【Method】 In this paper, a specific expression promoter p51408 related with stigma exsertion of wild rice (OryzarufipogonGriff.) from Yuanjiang City was cloned, the structural character of its sequence and expression feature of os51408 was analyzed. 【Result】With the construction of GUS expression vector and histochemical staining，the results showed that it was specific expression in stigma and style, no or low expression in root, stem, leaf and spikelet. 【Conclusion】So it could be a tissue-stigma specific expression promoter, and might play a very important role in rice stigma exsertion research.

Rice; Stigma exsertion; Specific promoter; Clone

S511

A

1001-4829(2017)11-2393-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.001

2016-07-09

国家自然科学基金项目(31200219)；江西省教育厅基金项目(GJJ151048)

周国华(1977- )，男，博士，主要研究方向：水稻杂种优势利用、水稻分子生物学，E-mail:zghynau@sina.com。