高效糯玉米单倍体加倍方法的研究

2017-12-01，，，，，

种子 2017年1期

关键词：秋水仙素单倍体糯玉米

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(吉林农业大学农学院，长春 130118)

高效糯玉米单倍体加倍方法的研究

邓昆鹏，李向永，景桂昕，鲁彬，邢政，赵仁贵

(吉林农业大学农学院，长春 130118)

以DR 5为父本诱导5份糯玉米杂交种获得的单倍体籽粒为试验材料，探究处理方法、浓度、处理时间和温度对糯玉米单倍体的加倍效果。结果表明，浸芽法的加倍效果最好，加倍率均值达11.02%。秋水仙素浓度为0.8 mg/mL时，加倍率最高，均值达10.47%。处理时间以8 h最好，加倍率均值达7.58%。处理温度为21 ℃时达到最佳，加倍率均值达10.96%。

糯玉米；单倍体；加倍率；

糯玉米(Waxy Corn)是玉米九大类型之一，又称为蜡质玉米，起源于中国的西南地区，是普通玉米第9号染色体上的基因发生隐性突变由WX突变为wx而形成的一种特殊玉米类型[1]。由于糯玉米100%的支链淀粉含量[2]，具有较高的粘滞性和适口性,经过蒸煮后的糯玉米粘软而富有糯性，使糯玉米深受人们欢迎。不仅仅在食用方面，随着社会的进步，糯玉米的用途越来越广泛。运用糯玉米可以酿制风味独特的优质黄酒，由于其100%的支链淀粉含量，使其成为加工支链淀粉的重要原料[3]。

在糯玉米育种研究方面，我国与国外相比发展缓慢[4]，一般采用回交转育法和二环系法，育成了一大批生产上推广面积较大的杂交种[5]，但上述方法存在流程繁琐、育种周期长、成本高等诸多问题，不易满足现实的生产需求，因此需要一种新的育种方法来代替。单倍体育种是利用孤雌生殖诱导系诱导杂交种产生单倍体，然后对单倍体进行加倍获得双单倍体即DH系的育种方法。常规玉米育种方法需要自交5～7代才能获得比较稳定的自交系，而单倍体育种只需要2代即可获得稳定的自交系，大大缩短了育种年限，对推进品种的更新具有重要作用[6]。就目前来看，单倍体育种在普通玉米育种方面应用比较广泛，而在糯玉米育种上的研究和应用还比较少。

在单倍体育种上，加倍率是限玉米DH育种的关键因素之一[7-8]。单倍体加倍一般采用秋水仙素加倍和自然加倍，自然加倍率比较低[9]，应用秋水仙素处理加倍比较普遍。本试验主要探究温度、秋水仙素浓度、处理方法和处理时间对糯玉米单倍体加倍率的影响，从而推进单倍体育种技术在糯玉米育种方面的应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所采用的单倍体诱导系为吉林农业大学特用玉米育种团队引进的新型诱导系DR 5。2014年冬在海南育种基地分别以基础材料吉白糯115、吉香糯187、京科糯2000、吉糯288、吉糯420为母本，进行杂交诱导，然后在F1中挑选胚为无色，胚乳为紫色的单倍体作试验材料。

1.2 试验设计及方法

1.2.1对上述5种基础材料诱导出来的单倍体用5种秋水仙素浓度0.6 mg/mL加倍方法和自然加倍法，其中浸种、浸芽和浸根在20 ℃条件下处理8 h，然后种植进行鉴定其加倍率，对数据进行统计处理。

1.2.2以吉白糯115为基础材料，在20 ℃条件下用浸芽法处理诱导的单倍体，在不同秋水仙素浓度不同处理时间下进行加倍，然后种植鉴定。

1.2.3以5种糯玉米品种为基础材料，诱导获得的单倍体在不同温度下，在0.6 mg/mL秋水仙素浓度下用浸芽法浸泡8 h，然后种植鉴定。

2 结果与分析

2.1 5种糯玉米单倍体用不同方法处理的加倍率

试验结果表明，5种糯玉米单倍体用6种方法进行加倍,效果见表1。利用无重复双因素方差分析表明，处理方法间达到极显著水平，品种间未达到显著水平。说明处理方法是影响糯玉米单倍体加倍的重要因素。由表3可看出，5种加倍方法除植株注射法外，加倍率均极显著高于自然加倍，说明前4种药剂处理具有明显的加倍效果，平均加倍率达3.82%～11.02%，植株注射法与自然加倍法差异不显著，原因是本试验秋水仙素浓度用注射法对单倍体苗的毒害比较大，注射法平均加倍率为1.50%。而自然加倍率平均只有1.14%。6种加倍方法中，浸芽法加倍效果最好，平均加倍率达到11.02%，极显著高于其方法。浸根法也具有较好的加倍效果，达到6.28%，仅次于浸芽法的加倍效果。浸种法和摘心叶法也显著高于植株注射法和自然加倍法。因此，浸芽法最适合于糯玉米单倍体加倍，是糯玉米单倍体加倍的首选方法，浸根法次之。

表1 5种糯玉米单倍体用不同方法处理的加倍率(%)

加倍方法吉白糯115吉香糯187京科糯2000吉糯288吉糯420浸种4．25．63．22．07．5浸芽11．68．511．912．410．7浸根5．86．37．16．75．5摘心叶3．32．84．55．33．2植株注射1．22．21．30．52．3自然加倍0．51．30．22．21．5

表2 方差分析

变异来源平方和自由度均方F值区组间1．9840．490．27处理间330．83566．1736．16∗∗误差36．60201．83总变异369．4029

注：“**”为达到0.01极显著水平。下同。

表3 5种糯玉米单倍体用不同方法处理的加倍率差异显著性比较

处理方法平均加倍率(%)5%显著水平1%极显著水平浸芽11．02aA浸根6．28bB浸种4．50bcBC摘心叶3．82cCD植株注射1．50dD自然加倍1．14dD

2.2 吉白糯115在不同浓度不同时间下的加倍效果

在20 ℃条件下，在不同浓度不同浸泡时间下浸芽的加倍效果见表4，无重复双因素方差分析表明(表5)，浓度间、时段间均达到极显著差异。说明秋水仙素的浓度和浸泡的时间是影响糯玉米单倍体加倍的重要因素。

由表4可知，在相同处理时间下，随着浓度的增高，加倍率越来越高，达到一定浓度后，会出现抑制作用，浓度再增加加倍率反而下降。这可能是由于秋水仙素具有一定的毒性，浓度太大对单倍体的毒害也比较大，从而导致了加倍率的下降。由表6可知，当浓度为0.8 mg/mL时，加倍率范围为9.5%～12.4%，平均加倍率最高达10.47%，极显著高于其它浓度。浓度为0.6，1.2 mg/mL时，平均加倍率差异不显著，分别为6.93%、6.60%。浓度为0.2，1.4 mg/mL时，平均加倍率最低，分别为4.10%和2.07%。不同浸泡时间的加倍效果的差异显著分析表明(表7)，8 h的处理与4 h和12 h处理的时段间差异达极显著水平。说明8 h处理的加倍效果最好，加倍率范围为2.4%～12.4%，平均加倍率为7.58%。12 h和4 h效果不佳，差异不显著，分别为5.48%、5.04%。

表4 吉白糯115在不同浓度不同时间下的加倍率(%)

浓度(mg/mL)4h8h12h0．23．55．66．20．66．38．310．60．89．512．410．51．24．47．36．51．44．52．42．3

表5 方差分析

变异来源平方和自由度均方F值浓度120．77430．1932．40∗∗时间18．4329．219．89∗∗误差7．4580．93总变异146．6514

表6 吉白糯115在不同浓度下的加倍效果差异显著性比较

浓度(mg/mL)平均加倍率(%)5%显著水平1%极显著水平0．810．47aA0．66．93bB1．26．60bBC0．24．10cCD1．42．07dD

表7 吉白糯115在不同处理时间下的加倍效果差异显著性比较

时间(h)平均加倍率(%)5%显著水平1%极显著水平87．58aA125．48bB45．04bB

2.3 5种糯玉米单倍体在不同温度处理下的加倍率

由表9可知，品种间未达到显著差异，温度间达到极显著差异。说明温度是影响糯玉米单倍体加倍的重要因素。

由表8可知，在品种相同的情况下，随着温度的升高，糯玉米单倍体加倍率先增加，达到一定温度后，加倍率逐渐下降。温度为21 ℃时加倍效果最好，加倍率范围为8.4%～13.9%，平均加倍率为10.94%，显著高于其它温度。由表8和表10可知，当温度为18 ℃和24 ℃时，加倍率范围分别为6.4%～10.4%和5.7%～8.2%，平均加倍率分别为8.54%和7.08%，仅次于21 ℃时的平均加倍率。当温度过高时，加倍率明显下降，30 ℃时加倍率最低，范围为 1.2%～3.3%，显著低于27 ℃条件下的加倍率，原因可能是温度过高的情况下糯玉米单倍体芽吸收的秋水仙素比较多，造成了较大的药害。而温度过低时，芽吸收的秋水仙素比较少，导致了加倍率较低。15 ℃时，加倍率范围为3.5%～6.3%，平均加倍率为4.88%，极显著低于18 ℃条件下的平均加倍率。

表8 不同处理温度下糯玉米单倍体加倍率(%)

温度(℃)吉白糯115吉香糯187京科糯2000吉糯288吉糯420156．34．55．53．54．61810．38．37．36．410．42110．313．98．412．49．8248．26．45．77．87．3275．66．74．35．63．5303．32．42．23．21．2

表9 方差分析

变异来源平方和自由度均方F值品种间11．9142．981．58温度间225．92545．1823．93∗∗误差37．76201．89总变异275．5929

表10 不同处理温度的加倍率差异显著性比较

温度(℃)平均加倍率(%)5%显著水平1%极显著水平2110．96aA188．54bAB247．08bBC275．14cC154．88cCD302．46dD

3 结论与讨论

单倍体育种技术在现代作物遗传育种中占据重要地位，随着单倍体育种技术的发展，育种家培育出越来越多的玉米优良DH系，为推进玉米新品种的选育，做出了重要贡献。单倍体育种技术在国外的研究比较广泛，技术也相对比较成熟，很多国外的育种公司都选用单倍体技术培育自交系。目前，我国也越来越重视单倍体育种技术，但是发展还是比较缓慢，技术不够成熟。在糯玉米育种上的研究和应用则是更少。

在糯玉米单倍体育种技术中，加倍率仍然是限制其发展的重要瓶颈。找到高效的糯玉米单倍体加倍技术，是推进该项技术研究和应用中的重要环节。从普通玉米单倍体加倍方法来看，秋水仙素浓度、温度、浸泡时间、处理方法是影响加倍率的重要因素。本研究选取5种糯玉米杂交种诱导得到的单倍体为试验材料，比较了6种糯玉米单倍体加倍方法，研究结果方差分析表明，单倍体处理方法间存在极显著差异，说明加倍处理方法是影响糯玉米单倍体加倍的重要因素。而品种间的差异不显著，但在普通玉米单倍体加倍上，当品种的血缘关系比较远时，品种间差异显著[10]。估计可能与本研究选取的基础材料的血缘关系比较近有关，还需要进一步研究，才能更能清楚这一机理。5种秋水仙素加倍方法除植株注射法外，其它加倍率均极显著高于自然加倍，说明合适的药剂处理方法具有明显的加倍效果，前4种加倍方法平均加倍率达3.82%～11.02%，而自然加倍率只有1.14%。6种加倍方法中，浸芽法加倍效果最好(达11.02%)，显著高于其它5种方法，说明浸芽法是适合糯玉米单倍体加倍的较好方法。

在普通玉米单倍体加倍上，浸芽处理时间经常是8 h，浓度为0.6 mg/mL左右。本研究选取吉白糯115诱导获得的单倍体为基础材料，用浸芽法在不同浓度不同时间下进行处理，方差分析表明，浓度间和处理时段间均存在极显著差异，说明浓度和时间是重要的影响因素。当浓度为0.8 mg/mL时，平均加倍率最大达到10.47%，极显著高于其它浓度。8 h处理的加倍效果最好，平均加倍率为7.58%。说明在糯玉米单倍体加倍上，适合选用8 h处理时间，适合选用的浓度为0.8 mg/mL。

在品种相同的情况下，随着温度的升高，糯玉米单倍体加倍率先增加，达到一定温度后，加倍率逐渐下降。温度为21 ℃时加倍效果最好，加倍率范围为8.4%～13.9%，平均加倍率为10.96%。极显著高于其它温度的。说明糯玉米单倍体加倍适合温度为21 ℃左右。

由于秋水仙素是剧毒药品，目前在普通玉米上研究了除草剂甲基胺草磷，炔苯酰草胺和氟乐灵来代替秋水仙素，但效果不甚理想[11]，这些药品在糯玉米单倍体加倍上效果怎样，还需要进一步的研究。

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