苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

， ， ， ，， ， ， (.广西农业科学院蔬菜研究所， 南宁 530007； 2.广西作物遗传改良生物技术重点实验室， 南宁 530007)

苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

黄玉辉1,2，黄如葵1,2，梁家作1，黄熊娟1，冯诚诚1,2，陈小凤1，刘杏连1，秦健1
(1.广西农业科学院蔬菜研究所， 南宁 530007； 2.广西作物遗传改良生物技术重点实验室， 南宁 530007)

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选，建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系。结果表明：使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白，更适用于双向电泳分析，结合使用pH=5～8 IPG胶条以及优化的聚焦程序，能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱。经银染显色，可检测约660个蛋白点，主要分布在pH=5～8；该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组。

苦瓜种子； 蛋白质组； 双向电泳； 系统优化

苦瓜(MomordicacharantiaL. ) 系葫芦科苦瓜属的一年生草本植物, 含有药用有效成分及丰富营养物质, 具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等功效[1-4],目前对于苦瓜的药用成分及其功效的研究已成为当前不同领域学者都感兴趣的一个热点。双向电泳(2-dimensional electrophoresis,2-DE)技术是蛋白质组学研究中的一种蛋白质分离方法， 近年来, 双向电泳技术已广泛应用于基础研究、医学、农业等各个领域。本研究采用TCA-丙酮法、丙酮法和酚抽提法对苦瓜种子总蛋白质的提取方法进行比较筛选和对双向电泳体系进行优化, 为苦瓜种子蛋白质组学的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料MC 26为泰国苦瓜品种。

提取液Ⅰ：0.5 mol/L Tris-HCl(pH=7.5),50 mmol/L EDTA (pH=8.0),0.7 mol/L蔗糖,0.1 mol/L KCl；提取液Ⅱ：65 mmol/L Tris-HCl(pH=6.8),10%甘油,0.5%SDS；提取液Ⅲ：0.5 mol/L Tris-HCl (pH=7.5),1 mol/L PMSF,1 mmol/L DTT,0.01 mol/L KCl；裂解液： 2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素,60 mmol/L DTT，2%(v/v)IPG缓冲液,2%(m/v)Chaps；水化液：8 mol/L尿素,40 mmol/L DTT,2%(m/v)Chaps, 1%(v/v)IPG缓冲液,1%溴酚蓝；平衡液：6 mol/L 尿素,35 mmol/L Tris-HCl(pH=8.8),2%(m/v)SDS,20%(v/v)甘油, 1%溴酚蓝。

1.2 方 法

1.2.1 总蛋白的提取方法

1) 酚抽提法。蛋白提取主要参考Saravanan等[5]的方法。称取1 g苦瓜种子(去壳)用液氮研磨成粉,然后加入10 mL提取液Ⅰ,涡旋混匀后于4 ℃放置20 min,然后再加入10 mL Tris饱和酚,混匀后于4 ℃放置20 min,4 ℃下12 000 r/min离心10 min,取上清液,加等体积提取液Ⅰ重复抽提2次。转移上清液,加5倍体积0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液,-20 ℃下放置过夜,于4 ℃下12 000 r/min离心10 min,沉淀用5 mL 0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液洗3次,晾干,即为提取的粗蛋白。

2) 丙酮法。称取1 g苦瓜种子(去壳)用液氮研磨成粉，加5倍体积的冷丙酮(含0.07%ME),振荡涡旋,4 ℃下12 000 r/min离心10 min,重复2次。待丙酮挥发完全,加入3倍体积的蛋白提取液Ⅱ,充分混匀,于4 ℃放置1 h(每隔10 min振荡1次)。4 ℃下12 000 r/min离心10 min,去沉淀。上清液加5倍体积的冷丙酮(含0.07%ME),-20 ℃沉降蛋白1 h,12 000 r/min离心10 min,沉淀用80%冷丙酮洗2～3次，于-80 ℃冷冻干燥。

3) TCA-丙酮法。主要参考Damerval等[6]的方法。称取1 g苦瓜种子(去壳)用液氮研磨成粉,然后加入15 mL蛋白提取液Ⅲ，充分混匀后4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液。加入25 mL 10%三氯乙酸和PMSF溶液，涡旋混匀后4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入25 mL冷丙酮，置-20 ℃过夜。第2天取出4 ℃下12 000 r/min离心10 min，沉淀用80%冷丙酮洗2～3次，于-80 ℃冷冻干燥。

1.2.2 第一向等电聚焦( IEF)电泳

采用PROTEAN IEF Cell(BIO-RAD)等电聚焦系进行等电聚焦, IPG干胶条分别为长17 cm、pH=3～10和长17 cm、pH=5～8两种。分别设计3个等电聚焦(IEF)电泳参数,筛选合适的IEF条件。Ⅰ：50 V，10 h； 500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，1 h；8 000 V，20 000 Vh；Ⅱ: 50 V，12 h；250 V，1 h；500 V,1 h,1 000 V,1 h；3 000 V,1 h；80 00 V ，80 000 Vh；Ⅲ:50 V，12 h；250 V,1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；3 000 V，1 h；10 000 V， 60 000 Vh。

1.2.3 第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

聚丙烯酰胺凝胶制备采用垂直电泳系统制备，参照郭尧君[7]的方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶浓度为12%(40%单体36 mL，Tris缓冲液30 mL pH=8.8，10%SDS 1.2 mL，ddH2O 52.8 mL，APS 0.6 mL，TEMED 0.06 mL),电泳参数为80 V 30 min左右，之后为200 V 5 h，直至溴酚蓝前沿到胶下底部停止电泳。取出玻璃板并小心撬开，凝胶切角作记号，采用银染染色法对凝胶进行染色[8]。

2 结果与分析

2.1 单向SDS-PAGE分析

计算样品蛋白液用量后，采用12%的分离胶浓度取蛋白上清液进行SDS-PAGE，在相同上样蛋白量条件下，TCA-丙酮法、酚抽提法和丙酮沉淀法分别得到23、19、13 条蛋白条带，TCA-丙酮法得到的蛋白电泳条带数量最多、浓度大且清晰,分离效果很好,说明该方法提取的蛋白质量好；而酚抽提法和丙酮沉淀法相对于TCA-丙酮法提取的蛋白存在部分条带缺失，蛋白浓度也较低，比较3种提取方法从单向SDS-PAGE(图1)可看出,TCA-丙酮法比其它2种方法更适用于苦瓜种子全蛋白的提取。

注：A为TCA-丙酮法;B为酚抽提法;C为丙酮沉淀法。下同。图1 苦瓜种子总蛋白SDS-PAGE电泳图

2.2 不同提取方法双向电泳的比较

比较采用TCA-丙酮法、酚抽提法和丙酮沉淀法3种方法提取的苦瓜种子全蛋白进行双向电泳的图谱发现，采用pH=3～10宽范围的胶条进行电泳时，蛋白点都比较集中，其中TCA-丙酮法2-DE图谱中蛋白点较多(图2-A),而酚抽提法和丙酮沉淀法蛋白质相对TCA-丙酮法蛋白点明显减少,缺失蛋白点较多( 图2-B、C)。由此得出TCA-丙酮法适用于苦瓜种子总蛋白提取，是进行双向电泳分析的最优方法。

图2 不同蛋白提取方法的苦瓜种子总蛋白的2-DE图谱

注：A为聚焦程序Ⅰ图谱;B为聚焦程序Ⅱ图谱;C为聚焦程序Ⅲ图谱图3 不同聚焦程序下的苦瓜种子总蛋白的2-DE图谱

2.3 IPG胶条pH选择

选用线性宽范围的pH=3～10胶条进行双向电泳时(见图2-A)，发现大部分蛋白质点集中在等电点为pH=5～8范围内，两端蛋白点较少，造成中间蛋白点重叠分不开，导致集中的蛋白点分辨率较低，影响电泳图谱分析。而选择同样长度的线性窄范围pH=5～8 IPG胶条,能更好的把蛋白点间的距离拉大，分离蛋白点，得到背景清晰、分离效果好的蛋白质图谱(见图3-C)。

2.4 最佳等电聚焦条件的优化

本试验在参考BIO-RAD公司提供的《双向电泳原理与方法》等电聚焦程序的基础上,对等电聚焦电泳的运行参数进行了不同调整设置， 优化筛选最佳的苦瓜种子蛋白质双向电泳的等电聚焦运行参数，结果见图3。采用程序Ⅰ和程序Ⅱ得到的电泳图谱结果不理想，背景横向条纹较重，部分点存在拖尾的现象，蛋白点模糊不清，分辨率相对较差。采用程序Ⅲ进行2-DE效果最佳，在凝胶上显现的蛋白质点分离效果好、蛋白点清晰、分辨率高，背景干净；这表明程序Ⅲ是最适于苦瓜种子蛋白质双向电泳分离的等电聚焦条件。

2.5 不同发育阶段苦瓜种子蛋白质2-DE图谱的比较

经蛋白质提取方法的筛选和双向电泳体系的优化后，本试验对不同发育阶段的苦瓜种子蛋白质进行双向电泳分析。结果(见图4)表明,在苦瓜种子发育前、中、后期,蛋白质的种类和表达量存在明显差异。可见,采用TCA-丙酮法提取蛋白, pH=5～8的IPG胶条及合适的IEF电泳参数进行双向电泳可有效分离苦瓜种子的蛋白,图谱清晰，分辨率好，重复性佳，可用于苦瓜种子差异蛋白质组学研究。

注：A为16 d;B为22 d;C为28 d。图4 不同发育阶段苦瓜种子蛋白质双向电泳图谱比较

3 讨 论

在双向电泳中，为了获得最佳的电泳效果，必须不断优化样品制备和第一向等电聚焦的条件，以确保蛋白样品得以充分分离，而不同蛋白样品的最佳IEF条件可能相差甚远，因此不同样品必须单独摸索。蛋白质样品的制备是双向电泳结果的好坏决定因素之一。蛋白的提取方法种类很多，材料不同，方法差别很大。苦瓜种子中主要由蛋白质，脂肪、激素等化学物质组成[9],为达到样品蛋白的最大抽提量，选择合适的裂解缓冲液，通过不同试剂的合理组合，在蛋白提取过程中去除脂肪、核酸、多糖等大分子以及盐类小分子等干扰物质成为关键所在。双向电泳的第一向等电聚焦中聚焦时间和总伏时数影响到2-DE图谱的质量，聚焦时间过短使得聚焦不完全，聚焦时间过长，引起胶内渗水，并且改变了凝胶的内部电场微环境，使得蛋白质样品再次发生移动，导致横纹。因此，等点聚焦运行的参数至关重要，直接影响到双向电泳图谱的重复性和分辨率。

本研究通过对苦瓜种子蛋白质的提取和双向电泳体系的优化, 建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系。试验结果表明：采用TCA-丙酮法提取蛋白,选用pH=5～8的IPG胶条为载体及合适的IEF电泳参数进行双向电泳，蛋白点分辨率好，数量较多，重复性佳，能充分反映蛋白质组信息，为适合苦瓜种子蛋白分离的双向电泳体系，为后续研究创造条件。

[1]许红心,倪坚军.苦瓜的药用研究概况[J].浙江中医学院学报,2011,25(4):73-75.

[2]邓向军,徐斌,董英.苦瓜化学成分的研究进展[J].时珍国医国药,2006,17(12):2 449-2 451.

[3]Grover J K,Yadav S P.Pharmacological actions and potential uses ofMomordicacharantia:a review.[J].Ethnopharmacology,2004,93:123-132.

[4]傅明辉.苦瓜籽蛋白的分离纯化及其抗氧化活性研究[J].药物生物技术,2001,8(5):248-250.

[5]Saravanan R S,Jocelyn KC.RA critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomcs,2004,4(9):2 522-2 532.

[6]Damerval C,De Vienne D,Zivy M,et al.Technical improvements in two-dimensional electrophores is increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins[J].Electrophoresis,1986,7(1):52-54.

[7]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社,1999.

[8]Blum H,Beier H,Gross H J.Improved silver staining of plant-proteins，RNA and DNA in polyacrylamide gels[J].Electrophoresis,1987(8):93-99.

[9]Mayer A M,Poljakoff-Mayer A.The germination of seeds[M].New York:Pergamon Press Ltd,1982.

Optimiztion of Two-dimensional Gel Electrophoresis for Proteome of Momordica charantia Seed

HUANGYuhui1,2,HUANGRukui1,2,LIANGJiazuo1,HUANGXiongjuan1,FENGChengcheng1,2,CHENXiaofeng1,LIUXinglian1,QINJian1
(1.Vegetable Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab,Nanning 530007,China)

Through optimization and screening of two-dimensional electrophoresis sample preparation methods of seeds protein of Momordica charantia,the procedure of isoelectric focus，concentration of the second-dimensional SDS separation gel and the pH range of solidifying strips,electrophoresis system that was suitable to seed protein of Momordica charantia was structured.The results showed that highly pure seed protein can be obtained with trichloroacetic acid(TCA)-acetone method,2-DE images of protein of high resolution ratio and good repetitiveness can be got with optimized isoelectric focus procedure.About 660 clear protein spots were detected by two dimensional electrophoresis (2-DE) and silver staining with isoelectric points at pH 5-8.

momordica charantia seed; proteome; two-dimensional electrophoresis(2-DE);system optimization

2017-03-11

广西自然科学基金(2013 GXNSFDA 019010)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-25)；广西农业科学院基本科研业务专项(2015 YT 66)；广西农业科学院基本科研业务专项(2015 YZ 01)；广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2016 YM 24)。

黄玉辉(1978—)，女，广西宜州人；硕士，助理研究员，主要从事苦瓜分子辅助育种研究工作。

黄如葵，E-mail：:rkhuang@gxaas.net。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.10.042

S 642.5

A

1001-4705(2017)10-0042-04