杧果炭疽病菌漆酶基因lac1的克隆与序列特征分析

韦运谢 刘晓妹等

摘 要：【目的】为了探明胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）漆酶基因（lac1）的序列特征，进一步研究胶孢炭疽菌的分子致病机制，【方法】以杧果炭疽病菌为材料，采用同源克隆、SEFA-PCR和RT-PCR技术对lac1基因进行扩增、并对所获得的lacl基因进行了序列特征和预测蛋白保守结构域的分析。【结果】结果表明，该基因DNA和cDNA全长分别为2 996 bp、1 773 bp，编码区含3个内含子（大小分别为47 bp、50 bp和59 bp），推测编码590个氨基酸，其分子质量约为1174.50 kDa，等电点PI为5.36。系统进化树结果显示该基因编码的氨基酸序列与多种真菌的含铜氧化物酶聚为一类，其中与C. lagenarium laccase （BAB32575.1）的同源性最高，达73%。【结论】lac1基因具备真菌漆酶基因家族的序列特征，推测lac1基因可能参与调控C. gloeosporioides菌丝生长、色素生成和致病性等。

关键词： 杧果； 胶孢炭疽菌； 漆酶；克隆； 序列分析

中图分类号：S667.7 文献标志码：A 文章编号：1009-9980

漆酶（p-diphenol oxidase， Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，属多铜氧化酶（multicopper oxidase）家族，广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌中以及一些昆虫、细菌及黄蜂的毒液中[1]。漆酶活性与真菌孢子的萌发、色素生成、木质素降解利用有关，同时漆酶还可以保护病原真菌免受寄主植保素和鞣质等化合物的影响，在真菌对环境的适应和定殖过程中起着重要作用[2-3]。

杧果是世界第二大热带水果，其收获面积及产量仅次于香蕉。由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）引起的杧果炭疽病是世界杧果产区的重要病害，在果园常引起植株梢枯、叶枯及落花落果，在贮运期病果率为30%～50%、甚至100%，严重影响杧果的产量和品质，是限制杧果产业发展的主要因素之一[4]。随着分子生物学技术的发展，已经鉴定并克隆了该病原菌一些致病相关基因[5]，但未见关于漆酶基因方面的研究。本研究的目的是用同源克隆等方法，从C. gloeosporioides中克隆漆酶基因，并通过生物信息学分析预测其功能，为下一步研究其在C. gloeosporioides致病过程中的作用打下基础，以便我们更好地了解C. gloeosporioides与杧果之间的互作机制，最终为杧果炭疽病防治提供新的作用靶标。

1 材料和方法

1.1 材料

杧果炭疽病病菌胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz.）单孢菌株A2，由中国热带农业科学院环植所热带果树病害课题组鉴定、提供。

1.2 方法

1.2.1 杧果炭疽病病菌菌丝的收集与核酸的提取

收集用PDA培养4～5 d的菌丝。DNA的提取按照BioMiga Fungal gDNA Kit说明书操作。RNA的提取按照参照AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit操作。

1.2.2 从基因组扩增lac1基因片段 参照文献[6]，设计lac1基因上下游引物：lac-F（5′-GGA ATTCTGGTAYCACAGCCACTT-3′）和lac-R（5′-GGAATT CTCRTGGCCRTGAAGRTG-3′）。以C. gloeosporioides基因组DNA为模板，扩增体系（50 μL）： 10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）4 μL；lac-F （10 μmol·L-1）和lac-R （10 μmol·L-1）各1 μL；TaKaRa Taq 0.5 μL；DNA模板1 μL；加ddH2O补至50 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃，8 min。PCR产物的凝胶回收、连接分别按照TIANGEN和TaKaRa相应试剂盒说明书操作。

1.2.3 SEFA-PCR 获得lac1基因全长 参照文献[7]快速染色体步移法（Self-Formed Adaptor PCR， SEFA-PCR）引物设计原理，根据已获的lac1基因片段序列设计扩增5′端和3′端的引物。扩增5′端引物：5A2L1 （5′-CCACAGCATTGACGCCCTTTCCG-3′）； 5A2L2（5′-AGTCGCTGATGGCATAAGGACCGAG-3′）；5Hemin-A2L3（5′-GATGAAAAGTGGNNNNNN NNNCTGTGA-3′）。扩增3′端引物：3A2L1（5′-TGGACTCCCTACCCAACCAGGATACCCC-3′）；3A2L2（5′-TCACTCCCCACAAGAACATTCTCGACG -3′）；3Hemin-A2L3（5′-GAAGAATTACACTTTNNNNNNN NNCATGGA -3′）。

1）SEFA-PCR第一步的扩增： 扩增体系（30 μL）：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus） 3.0 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1） 3.0 μL，Hemi-A2L3（10 μmol·L-1） 1.0 μL，模板DNA 1.5 μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1） 0.5 μL，补ddH2O至30 μL。扩增条件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 3 min，以每秒增加0.2 ℃的速度升至70 ℃， 70 ℃ 5 min。取出PCR管加入1.0 μL 引物A2L1（10 μmol·L-1）后继续扩增，扩增条件：94 ℃ 30 s，70 ℃ 5.5 min，25个循环。接下来进行8轮不对称PCR，扩增条件：94 ℃ 30 s，70 ℃ 5.5 min，2个循环；94℃ 30 s，50 ℃ 30 s，1个循环；8轮不对称PCR完成后再70 ℃延伸5 min。

2）SEFA-PCR第二步的扩增： 扩增体系（30 μL）：引物A2L2（10 μmol·L-1）1.0 μL，模板为第一步扩增产物1.5 μL，其余同第一步扩增。扩增条件94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s（5端）/62 ℃ 30 s（3端），72 ℃ 5 min，33个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.4 序列拼接与验证 利用DNAssist 1.0软件将所得5′端和3′端序列与lac1基因片段序列拼接获得其初步的全长序列。再从两端设计引物，用高保真酶扩增、测序，验证已获得序列的正确性。

1.2.5 RT-PCR法扩增获得lac1的cDNA序列 用DNAssist 1.0软件对所得lac1基因全序列与GenBank中的瓜类炭疽菌（C. lagenarium）的lac1基因cDNA序列（登录号：AB055709.1）比对分析后，用推定的cDNA序列设计引物对A2Rlac1（5′-TTGGATACACGCACGGATTG-3′）和A2Rlac2（5′-AACTGCACGCTGAGACCC-3′），按照TIANScript cDNA First-Stand Kit说明书操作，扩增lac1基因的cDNA片段并克隆、测序。

1.2.6 lac1序列分析 利用DNAssist 1.0软件比对分析所获得的lac1基因DNA和cDNA序列，找出开放读码框、Kozak序列、起始密码子、终止密码子、外显子、内含子。利用BioEdit软件分析lac1基因编码序列的化学特征。用Primer 5.0软件推测lac1基因编码的氨基酸序列。用ExPASy软件包中Computer PI/MW软件对该蛋白序列组分进行分析。

2 结果与分析

2.1 lac1基因片段扩增结果

用引物对lac-F和lac-R，以杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌基因组DNA为模板扩增约1 000 bp片段这与所预测的序列长度相一致。用Blastn 分析发现，该片段与多个不同物种的漆酶基因序列有很高的相似性，说明该片段为胶孢炭疽菌漆酶基因片段，定名为lac1基因片段。

2.2 SEFA-PCR 获得lac1基因全长

根据已获得的lac1片段序列设计SEFA-PCR引物，经过两步成功扩增获得该片段上下游侧翼区域测序表明，5′端序列长1 147 bp，3′端长1 214 bp。

2.3 RT-PCR扩增获得lac1的cDNA序列

经RT-PCR扩增获得约1 700 bp的cDNA片段测序表明大小为1 773 bp。该序列已提交在GenBank上，登录号为JQ762259.1。

2.4 lac1序列分析

2.4.1 lac1基因全长DNA与cDNA序列分析 比对分析lac1基因DNA和cDNA序列，发现含1个1 773 bp大小的开放阅读框，起始密码子ATG位于381～383 bp处，终止密码子TAA位于2 308～2 310 bp处，自ATG到TAG的DNA全长1 930 bp，其中存在3个大小分别为47 bp、50 bp和59 bp的内含子（位于583～629 bp，785～834 bp和977～1035 bp处），是典型的真菌内含子的长度（49～85 bp），所有内含子均符合GT-AG法则。

用BioEdit软件分析结果表明，lac1基因编码序列的双链核苷酸分子质量大小为1174.50 kDa，（G+C）mol%为55.57%，（A+T）mol%为44.43%，可见该编码区富含GC碱基，其中C的摩尔百分含量为31.67%。

2.4.2 lac1基因预测蛋白的化学特征分析 用Primer5.0软件预测lac1基因编码590个氨基酸。分子质量约为65.46 kDa，包括65个强碱性氨基酸（KRH），65个强酸性氨基酸（DE），235个非极性氨基酸（AILPWVFM），355个极性氨基酸（CDEGHKNQRSTY），等电点（PI）为5.36，可见是一种酸性蛋白质，富含极性氨基酸，特别是苏氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）的含量分别达8.97%和8.46%。

2.4.3 lac1基因预测蛋白的同源性分析 将该基因编码的氨基酸序列提交NCBI进行BLASTP同源比对，分析表明该漆酶与已发表的C. lagenarium laccase （BAB32575.1），Glomerella graminicola M1.001 multicopper oxidase （EFQ28232.1），Magnaporthe oryzae 70-15 laccase-2（EHA55280.1），Verticillium dahliae VdLs.17 laccase-1（EGY13352.1）和V. alboatrum VaMs.102 laccase-2 （XP-003008743.1）基因编码蛋白同源性较高，相似性在50%以上。其中与同属的瓜类炭疽菌聚为一小分支，亲缘关系最近，相似性达73%。按物种分类地位进行聚类：进化树可分为两大分支，上一分支主要是子囊菌，而下一分支主要是半知菌。系统聚类结果表明（图4）：lac1预测蛋白可能与瓜类炭疽菌（C. lagenarium）的laccase类或禾生炭疽菌（G. graminicola）的multicopper oxidase聚为一类。

2.4.4 lac1基因预测蛋白的保守结构域分析 利用NCBI的Blast软件（http：//www.nebi.nlm.nih.gov/strueture/cdd/wrpsb.cgi）进行lac1基因预测蛋白的结构域分析（图5），发现该蛋白中含有Cu-oxidase保守结构域，说明LAC1蛋白属于含铜的氧化物酶类。

3 讨 论

目前已知的漆酶基因大部分通过RACE技术获得的，本研究参考SEFA-PCR技术，结果显示，与其他从已知片段扩增5′和3′技术如RACE、Gene-walking 和TAIL-PCR等相比，该方法简单方便、经济、可靠性高，更适合扩增已知序列的侧翼序列。

漆酶广泛存在于植物和真菌中，植物漆酶参与木质素的合成及原生质体再生过程中细胞壁的重建[8]，而真菌漆酶的功能较为多样，Lentinus edodes 分泌的漆酶参与子实体形成[9]，Botrytis cinerea分泌的漆酶及板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）分泌的胞内和胞外漆酶与其致病性相关[10]，Aspergillus nidulans 和 A. fumigatus的分泌漆酶参与分生孢子形成和发育过程中的色素合成[11]，Heterobasidion annosum的侵染性和漆酶的表达密切相关[12]，玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的漆酶对分生孢子的形成、附着胞的侵染力及其黑色素的合成等起着重要作用[13]。本文克隆的lac1基因编码的蛋白与C. lagenarium 的lac1基因编码的漆酶有很高的序列相似性，而C. lagenarium的lac1基因与该真菌的黑色素合成和致病性有关，因此推测杧果炭疽病菌的 lac1基因可能也有相似的功能。但由于杧果炭疽病菌与上述真菌在生活史、侵入寄主的方式、致病因子等方面均存在差异，该基因的具体功能还有待进一步研究。

真菌中往往存在多种漆酶同工酶，如尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中存在6种同工漆酶[14]，小麦全蚀病菌（G. graminis var. tritici）中存在3种同工漆酶， Rhizoctonia solani中存在4种同工漆酶。同工酶基因序列和氨基酸序列也存在差异，如登陆号为EFQ28232.1和EFQ33805.1的禾生炭疽菌、为AAA33592.1和CAD70438.1粗糙脉孢菌的漆酶同功酶就有此特征。这可能是由于真菌漆酶多以同工酶形式存在，且由基因家族编码，除保守结构域外，其他位点存在较多的序列变异，真菌可能在不同的环境条件下或生长发育的不同阶段有选择性地表达这些基因[13，15]。本研究只从杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌中克隆到1个漆酶基因，是否也存在其他的漆酶同工酶基因有待进一步研究。

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