马哈利樱桃根际产吲哚乙酸细菌多样性及产素能力研究

赵柏霞+闫建芳+夏国芳+李俞涛+潘凤荣

摘要：分离6年生砂蜜豆/马哈利樱桃的根际细菌，通过16S rDNA基因序列分析确定分类地位，利用比色法筛选IAA产生菌并定量检测其产素能力。研究发现，共分离获得52株细菌，分属于2个类群11个属的17个种。对各代表菌株进行产素能力测定，共发现15株菌可分泌生长素，其中A07、A20、B20及B26菌株具有较强的产素能力。马哈利砧木作为辽东地区甜樱桃的主要砧木，其根际促生菌的多样性分析及菌株利用研究较少，本研究为甜樱桃增产及生物菌肥开发提供了重要菌株资源。

关键词：马哈利樱桃；根际细菌；多样性；吲哚乙酸；产素能力

中图分类号： S662.501 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0169-04

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）指生存于植物根际、根表，并能直接或者间接促进或者调节植物生长的微生物。这类微生物一般具有固氮、解磷、产生植物激素等能力或者至少其中之一的能力。1978年，研究人员首次在马铃薯上发现并报道了PGPR，经过了30多年的发展，这类菌被大量报道，其中包括了假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、固氮螺菌属（Azospirillum sp.）[1]、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）[2]、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[3-4]、固氮菌属（Azotobacter sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）[5]、节杆菌属（Arthobacter sp.）[6]、布克霍尔德氏菌属（Burkholderia sp.）[7]等。这些菌种部分已经作为新型肥料的菌源在农业生产中开发利用。Kumar等从葫芦巴的根瘤中分离的E. meliloti 和R. leguminosarum具有多重促生活性，并对Fusarium oxysporum具有一定的拮抗作用[8]。王光华等从大豆根际土壤分离到一株芽孢杆菌BRF-1，该菌对7种病原菌有较好的拮抗作用[9]。

马哈利[Cerasus mahaleb （L.） Mill.]是一种欧美普遍应用的甜樱桃砧木，该种樱桃根系发达，固地性好，耐旱、耐寒、耐贫瘠，是我国北方重要经济作物甜樱桃的主要嫁接砧木[10]。其根际促生菌的种类及数量对于甜樱桃产量有重要影响。但目前辽东地区对于该砧木根际微生物及PGPR菌的研究尚未见报道，其研究对甜樱桃的增产及品质提高具有重要意义。

本研究对6年生砂蜜豆/马哈利樱桃树的根际细菌进行分离鉴定，并以植物生长素吲哚乙酸（IAA）为指标进行产素能力测定，筛选到了马哈利根际促生细菌并明确了其产素能力，为生物促生菌肥的开发利用提供了丰富的资源。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

土壤样品采集自辽宁省大连市农业科学研究院甜樱桃园，采集时选择生长良好的6年生甜樱桃根部土壤，除去土壤表面覆盖的凋落物及杂物，铲除表面约5 cm厚的土壤，用灭菌铲采集5～20 cm深的根际土壤，装于灭菌袋中，过20目筛后4 ℃保存。

1.2 培养基

分离培养基为LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。IAA检测培养基为含L-色氨酸LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，色氨酸100 mg/L，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.3 菌株分离纯化

采用梯度稀释法分离土壤中细菌菌株，纯化后编号LB斜面上保存备用。

1.4 16S rDNA扩增

将菌株用LB培养液培养至对数生长期，离心收集菌体，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提取菌株总DNA。以细菌通用引物27F/1525R（引物1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3）进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系为Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应条件：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环；72 ℃、5 min。PCR扩增产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，4S Red（上海生工）染色后，在凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）中观察照相。

1.5 测序

16S PCR产物送往生工生物工程（上海）有限公司进行测序。测序结果在EzTaxon网站与细菌模式菌株的16S rDNA序列进行比对。用MEGA 6.0 对16S rDNA 基因相似度高的菌株构建系统发育树。将测得的16S rDNA全序列提交Genbank数据库（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）获得序列登录号。

1.6 IAA产生菌的筛选

将分离纯化后的细菌接种于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基中，30 ℃、120 r/min条件下振荡培养1 d。按照Libbert等的方法[11]进行显色反应。以加入50 μL IAA[50 mg/L，生工生物工程（上海）有限公司，纯度>99%]的标准液作为阳性对照，以加入50 μL无菌培养液作为阴性对照。白色陶瓷板置于避光条件下、室温反应30 min后，观察颜色变化，颜色变红者表示能够产IAA，且颜色越深表示分泌的能力越强，否则表示不能产生IAA。

1.7 IAA产素能力的测定

采用上述培養条件，对初筛获得能够分泌IAA的根际细菌进行定量测定，测定菌悬液的D600 nm值后，将菌悬液 10 000 r/min 离心10 min，取上清液按照Glickmann等的方法[12]测定D530 nm值。同时以分析纯IAA绘制吸光度-浓度标准曲线，以计算待测样品中IAA含量。endprint

2 结果与分析

2.1 可培养细菌16S rDNA扩增与测序

通过稀释分离法分离到细菌菌株52株，挑取培养形态不一致的菌株，以27F/1525R为引物进行16S rDNA片段扩增，得到长度约为1 400 bp的扩增片段，将所得的PCR产物进行测序，测序后得到的基因序列与EzTaxon细菌模式菌株的16S rDNA基因序列进行比对，用MEGA 6.0 对16S rDNA基因相似度高的菌株构建系统发育树。将序列提交GenBank，所得收录号为KX792235～KX792257。

试验结果（图1、表1）显示，筛选出的菌株分布在细菌域2个纲11个属17个种中。其中放线菌门（Actinobacteria）最多，占约70%，为最优势类群，分别归属于微球菌属（Micrococcus）、红球菌属（Rhodococcus）、链霉菌属（Streptomyces）、节杆菌属（Arthrobacter）等。其次是厚壁菌门，其中共有6株细菌与芽孢杆菌属（Bacilus）相似度高达99%～100%，占85.7%，为分离到的最优势菌属。

2.2 IAA产生菌的筛选

根据分离纯化结果，以23株根际细菌为代表进行分泌IAA性能测定，测定结果表明，23株根际细菌中共有15株具有分泌IAA的能力，但存在一定的差异。4株深粉色，4株粉色，7株浅粉色，颜色越深表明分泌IAA的能力越强（表2）。

2.3 PGPR菌的IAA产生能力测定

将初筛的具有分泌IAA能力的菌株进行定量测定，根据标准曲线计算IAA产生能力。结果（图2、图3）发现，分离自马哈利樱桃根际土壤的2个纲的根际细菌均有分泌IAA的能力，但是分泌能力有明显差异。其中显示深粉色的4株细菌为厚壁菌门中的B20（Bacillus aryabhattai）分泌能力最强，产IAA量为33.07 mg/L；其次是放线菌门的A07（Patulibacter americanus），产IAA量为21.24 mg/L；放线菌门的B26（Microbacterium oleivorans）分泌量位居第3，产IAA量为1890 mg/L；第4为放线菌门的A20（Agromyces neolithicus），分泌量为 18.84 mg/L。

3 结论与讨论

本研究对辽东地区重要经济作物甜樱桃的主要砧木马哈利根际的可培养细菌种群进行了研究，共分离获得52株细菌，分布属于11个属的17个种，显示了樱桃根际可培养细菌丰富的种群多样性。经显色筛选发现15株细菌可分泌生长素或其类似物，其中Patulibacer sp. A07、Agromyces sp. A20、Bacillus sp. B20 及 Microbacterium sp. B26菌株具较强的产IAA能力，均达到18 mg/L以上。这些种属和已经报道过的PGPR相似[13]。其中B20和B26所属的Bacillus、Microbacterium属已经在蔬菜、烟草及果树上被大量报道了具有促生功能[5，14-15]。而Patulibacer sp.和Agromyces sp.在国内外都罕有报道，本试验首次从马哈利樱桃根际分离到，并检测到具有产IAA能力。其中A07、B20等在盆栽试验中具有较好的促生作用（另文发表）。

大量资料表明，植物根际细菌是筛选PGPR的重要资源库。现有报道表明假单胞菌属和芽孢杆菌属的植物根际细菌具有防病促生的能力[16-17]。PGPR集中的一些菌属有假单胞菌属（Pseudomonas）、布克霍爾德氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属（Bacillus）等。本试验分离出的马哈利根际产IAA细菌，归属于4个目10余个属，即使有些菌种产IAA能力较低，但在一定程度上反映出马哈利根际土壤中蕴藏着丰富的微生物资源。这些菌种的产素能力受培养基、培养条件等因素影响很大。因此，可以通过筛选培养基和优化培养条件来提高产素能力。

本试验首次对砂蜜豆/马哈利樱桃的根际微生物进行研究，筛选出近60%的根际细菌都是具有产IAA能力的，这将为甜樱桃生物菌肥产业提供巨大的微生物资源，创造良好的根际生态环境，实现辽东经济产业的进一步增产创收。

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