三角槭秋叶色素的测定及时序变化分析

王红梅+王永平+陈丽如+王程

摘要：以三角槭叶片为试验材料，比较了不同浸提液和浸提时间对色素浸提效果的影响，并对测定期内温湿度的变化与叶绿素、类胡萝卜素、花青素含量变化的相关性进行了分析。结果发现，适合叶绿素的浸提液为丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提时间为50 h；适合花青素的浸提液为0.1 mol/L的HCl，浸提时间为50 h。测定期内随着温度的降低，叶绿素、类胡萝卜素都呈下降趋势，而花青素的含量呈上升趋势。叶绿素、类胡萝卜素、花青素与测定期内平均温度的相关性达显著水平，而与湿度的相关性不强。

关键词：三角槭；叶绿素；类胡萝卜素；花青素；时序变化；温度

中图分类号： S792.350.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0228-03

三角槭（Acer buergerianum Miq.）又名三角枫，为槭树科（Aceraceae）槭属落叶乔木，因其叶片秋季变为暗红色或橙红色，成为一种良好的彩叶观赏树种。其主要分布区位于长江流域，华北、华南、西南各省也有栽培[1]。对于彩叶树种变色机制的研究，国外起步较早，早在20世纪90年代，已有学者对红叶鸡爪槭和红花槭在不同环境条件下叶色的变化进行了研究[2-3]。近年来，国内关于槭树属植物的变色生理在红枫、紫花槭、白牛槭、拧筋槭、茶条槭、五角槭、自由人槭、红花槭等种或品种中已经有相关报道[4-7]，而对于三角枫变色机制的研究仅荣立苹等[1]进行了探索。

本研究以栽培于江苏农林职业技术学院内的三角槭优良单株为试验材料，研究其转色期叶片中叶绿素、花青素含量的变化，分析测定期内温湿度的变化与色素含量的关系，为进一步研究三角槭叶色变化的生理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为三角槭优良单株，现栽培于江苏农林职业技术学院，该单株生长健壮，于秋季叶色转为亮红色，落叶初期为12月。

1.2 试验方法

1.2.1 取样 本试验于秋季三角槭进入转色期开始测定，试验期为2015年10月28日至12月2日。每周采样1次，采样时取树冠向阳面中部当年生枝条的叶片[4，8-9]，同时利用温湿度测定仪观测采样期前1周内的温湿度变化。

1.2.2 色素的提取

1.2.2.1 叶绿素的提取 将采集的叶片用清水冲洗干净，擦干，避开主脉，剪碎，并混合均匀[8]。称取剪碎的叶片0.2 g，放入50 mL的三角瓶中，加入浸提液20 mL。浸提液分别为80%丙酮、丙酮 ∶ 无水乙醇=1 ∶ 1、95%乙醇。倒入浸提液后立即用保鲜膜封口，并用黑色塑料膜将整个瓶子包裹起来，防止漏光。将培养瓶放置于32 ℃的环境下避光恒温进行浸提，浸提时间分别设定40、45、50 h，浸提过程中摇动几次。试验采用双因素完全随机组合设计，每个试验处理重复3次。

1.2.2.2 花青素的提取 称取剪碎的叶片1 g，放入50 mL三角瓶，加入0.1 mol/L的HCl 10 mL，封口，遮光（方法同叶绿素的提取），采用单因素试验设计，试验因子为浸提时间（40、45、50 h），每个处理重复3次。

1.2.3 光密度的测定 用分光光度计在470、645、646、649、663、665 nm的波长下测定叶绿素的D值，在530 nm下测定花青素的D值[10]。

1.2.4 色素的计算 色素计算公式分别用3种不同浸提液的色素浓度（mg/L）的计算公式进行计算，并对计算结果进行比较。80%丙酮作为浸提液的的计算公式为：

Ca=12.72×D663 nm-2.59×D645 nm；（1）

Cb=22.88×D645 nm-4.67×D663 nm；（2）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（3）

丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1为浸提液的计算公式为：

Ca=12.21×D663 nm-2.81×D646 nm；（4）

Cb=20.13×D646 nm-5.03×D663 nm；（5）

Ccar=（1 000×D470 nm-3.27×Ca-104×Cb）/229。（6）

95%乙醇作为浸提液时的计算公式为：

Ca=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm；（7）

Cb=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；（8）

Ccar=（1 000×D470 nm-2.05×Ca-114×Cb）/245[11]。（9）

將上述浓度计算结果转换为色素含量，利用公式：

色素含量（mg/g）=色素浓度（mg/L）×浸提液体积（mL）/[1 000×叶片质量（g）]；（10）

计算色素的相对含量[12]。并对不同计算公式的计算结果进行误差率的对比。

花青素的计算，以1 g鲜质量叶在10 mL浸提液中的D值为0.1时的花青素浓度记为1个色素单位，计算花青素相对含量（色素单位）[4，13-17]。

1.2.5 温湿度的测定 空气温度和湿度的观测，利用空气温湿度自动记录仪于色素测定的前1周开始，每天进行观测和记录。统计到测定时为止1周的大气温湿度的最高、最低、平均值以及极差，并与色素含量变化进行相关性分析[13]。

2 结果与分析

2.1 叶绿素的不同浸提方法的比较

2.1.1 不同浸提效果比较 在比较不同浸提效果时，色素浓度的计算公式分别采用式（1）～（9），色素含量的计算利用公式（10），将计算出的色素含量采用SPSS 19.0进行方差分析和多重比较 （表1）。研究发现，处理4、5、6的叶绿素a、叶绿素b的平均含量之间没有显著差异，而这3个处理与其他各处理间均存在显著差异。类胡萝卜素平均含量在处理4～9之间无显著差异，而与其他处理间差异显著。综合分析得出：以丙酮与乙醇=1 ∶ 1的浸提液浸提效果最好，与其他2种浸提液间存在显著差异；而不同浸提时间的各处理间差异不显著。endprint

2.1.2 不同色素计算公式的比较 浸提液不同，色素的计算公式也不同。固定浸提时间为50 h，以3种不同浸提液浸提色素，并用相应的计算公式进行计算，对其计算结果与采用公式（4）～（6）计算的结果进行比较。以（4）～（6）计算结果为实测值，其他公式计算的为测定值，利用公式：误差率=（测定值-实测值）/实测值×100%，计算不同测定公式的误差率（表2）。

经误差率比较发现，采用不同浸提液计算公式的计算结果误差率相差很大（表2）。这就说明，在进行色素吸光度测定时波长的选择必须与浸提液的吸收峰对应，计算也必须运用相应的计算公式，而不能套用Lichtenthaler等对Arnon法进行的修正公式。

2.2 叶绿素的时序性变化

色素时序性变化的试验，均采用浸提液2（丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1），浸提时间为50 h。在测定期内，每7 d测定1次数据。研究发现，从2015年10月至12月，三角槭的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素a+b均呈短暂上升后急速下降，叶绿素a+b的含量从最大的4.19 mg/g降至0.27 mg/g，类胡萝卜素含量也有所下降，但下降幅度较为平缓（图1）。

2.3 花青素的时效性变化

研究发现，在测定期内花青素的相对含量随着时间的变化呈逐渐增加的趋势，由7.30增至17.50（图2）。

2.4 花青素相对含量、类胡萝卜素与总叶绿素比值的变化

研究发现，在测定期内，花青素与总叶绿素比值呈上升趋势，但开始上升较为缓慢，至11月中旬后，迅速上升。而叶绿素与类胡萝卜素比值变化幅度比较小（图3）。因此，测定株表现在叶片颜色上是由绿变黄并不明显，但随着花青素含量的增加，叶片呈现较明显的红色。

2.5 测定期内温湿度的变化

测定期内平均温度呈下降趋势，由19.9 ℃下降到 10.8 ℃（图4）。同时，平均湿度差呈现类似的下降趋势（图5）。

2.6 叶绿素、花青素与温湿度的相关性分析

对叶绿素和花青素含量的变化与温湿度变化进行相关性分析，结果发现，叶绿素a、类胡萝卜素的含量均与平均气温间存在较强的正相关，即随着气温的降低，叶绿素、类胡萝卜素含量均降低。其含量与相对湿度的相关性不强，即色素含量的变化受湿度影响较小。花青素的含量与平均气温间存在较强的负相关，随着气温的降低，花青素含量逐渐增加，反映了花青素在不断的合成和积累（表3）。因此， 叶片的颜色也逐渐变为红色。

3 结论与讨论

在三角槭叶片色素和花青素测定中，叶绿素的浸提液以丙酮 ∶ 乙醇=1 ∶ 1，浸提50 h，效果较好。使用不同浸提液必须使用此浸提液最大吸光度下的计算公式，而不能为了简便选择固定公式。

在色素含量的时序性变化中发现，随着平均气温的降低，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素均呈下降的趋势，而且叶绿素a、类胡萝卜素与平均气温之间存在较强的正相关。花青素的含量随着平均气温的降低而升高，两者呈现负的强相关。

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