几种中药提取液对番茄病害病原真菌的抑制效果

严希+田山君+裴芸+陈颖+张万萍

摘要：为探索中药在防治4种番茄病害病原真菌中的应用价值，对供试中药的水、乙醇提取液进行室内抑菌活性测定。结果表明，在7种中药中，肉桂、黄芩和桑白皮的乙醇提取液具有较好的抑菌活性，对4种病原真菌均有较好的抑制作用，且肉桂乙醇提取液的抑菌效果最佳，同时乙醇提取液的抑菌活性优于水提取液。肉桂乙醇提取液对4种供试菌的抑菌毒力方程和EC50分别为灰葡萄孢菌y=0.346x+0.122，EC50=1.09 g/L；尖孢镰刀菌y=1.638x+0.167，EC50=0.20 g/L；极细链格孢菌y=0.601x+0.177，EC50=0.54 g/L；草酸青霉菌y=1.719x+0.131，EC50=0.21 g/L。

关键词：中药提取物；番茄病害；病原菌；乙醇提取液；抑菌活性

中图分类号： S436.412.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0129-06

近年来，化学抑菌剂的使用已满足不了多样化的市场需求，而生物源抑菌剂以其低毒、高选择性[1]、易降解等特点，获得了新的发展机遇。国外对植物提取物抑菌性的研究比较深入，对紫衫[2]、夏季香薄荷[1]、木兰[3]等药用植物的研究均证实了药用植物提取液对植物病原菌的抑制效果。我国有丰富的中药资源，中药中含有大量具有抑菌活性的次级代谢产物，因此，研究中药的抑菌活性是生物抑菌剂开发的重要途径。有研究表明，部分中药对果蔬病原菌具有良好的抑制作用。喻大昭等发现，肉桂可以完全抑制白菜黑斑病病菌、黑曲霉病病菌等8种植物病原真菌，具有较强的广谱抑菌活性[4]；张新强等研究发现，黄芩对辣椒炭疽病病菌和番茄灰霉病病菌的抑制效果突出[5]；孫伟等比较了55种中药的抑菌活性，发现白芍和桑白皮对苹果腐烂病病菌和棉花立枯病病菌有强烈的抑制活性[6]；有研究表明，黄柏对灰葡萄孢菌和链格孢菌的抑制作用显著[7]，半夏对霉菌也有显著的抑制作用[8]。

本试验选取肉桂、黄芩、黄连、白芍、桑白皮、黄柏、半夏等7种中药，采用离体抑菌试验测定不同中药的浸提液对供试菌菌丝和孢子的抑制率，并以此作为抑菌效能的评价指标研究中药在番茄病害防治中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选取的7种中药均购于贵阳市太升中药材名品特产市场，中药的详细信息如表1所示。

1.2 供试病原菌

4株供试真菌分别为引起番茄灰霉病的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、引起镰刀果腐病的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、引起番茄假黑斑病的极细链格孢（Alternaria tenuissima）、引起番茄青霉果腐病的草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂条、1 000 mL蒸馏水。

1.4 试验方法

1.4.1 中药水、乙醇提取液的制备 将中药简单分拣，选取完整、无霉斑的中药置于鼓风干燥箱中20 ℃低温烘干过夜，粉碎后经80目的过滤筛筛选，制成中药粉末样品。精确称取4.0 g中药粉末样品，加100 mL水或乙醇混匀（物料比为 4 g ∶ 100 mL），然后置于35 ℃恒温摇床中，180 r/min振荡 24 h，抽滤滤去药渣，得水、乙醇粗提取液，待下一步浓缩精制。

将水粗提取液置于蒸发皿中，冷冻后进行低温冷冻干燥，然后取适量蒸馏水溶解，移至离心管离心，取上清液，再移至刻度试管定容，低温备用；将乙醇粗提取液置于蒸发皿中，于 20 ℃ 鼓风干燥箱中挥发，然后取适量乙醇溶解，移至离心管离心，取上清液，再移至刻度试管中定容，低温备用[9]。

使用水分测定仪测定含水率，重复3次。参照2010版中国药典附录X_A的浸出物测定法[10]，各取20 mL制备好的水、乙醇粗提液至蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，冷却30 min，精确称其质量，测出浸出物含量，按公式（1）计算提取率。

1.4.2 中药水、乙醇提取液抑菌活性的筛选

1.4.2.1 中药提取液抑制菌丝生长能力的测定 采用菌丝生长速率法，将中药水、乙醇提取液经0.22 μm滤膜过滤后与PDA培养基按1 ∶ 49混合铺平板，接种病原菌菌饼，27 ℃恒温培养至铺满2/3平板时，用十字交叉法测量菌落直径，菌落净直径=菌落直径-菌饼直径，按公式（2）计算菌丝抑制率。每个处理重复3次，以相应的提取剂作为对照。

1.4.2.2 中药提取液抑制孢子萌发能力的测定 采用崔志峰等的方法[11]配制孢子悬浮液，用血球计数板计算孢子浓度，并稀释至浓度为105个/mL。将中药提取液制成所需浓度的培养基（厚度≤3 mm），吸取0.1 mL孢子悬浮液，表面涂布，晾干后切取约2 cm×2 cm的小块，正面向上，置于平板内保湿，21 ℃黑暗培养24 h，记录孢子总数及萌发数量，按公式（3）计算孢子萌发抑制率。每个处理设3次平行，随机观察的视野数应在3个以上，观察的孢子总数不低于100个，以孢子的芽管长度超过孢子直径视为萌发。

1.4.2.3 中药提取液的抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法，设5个浓度梯度，每个浓度设3个平行，以水、乙醇为空白对照，将数据线性拟合，得出毒力回归方程，并计算出抑制中浓度EC50。

1.4.2.4 雷达图法综合评价中药提取液的抑菌能力 中药提取液抑菌能力的评价指标包括4种病原菌的菌丝抑制率和孢子萌发抑制率。采用雷达图法，进行多指标评价分析。

（1）评价指标的无量纲化处理：根据张卫华等的方法[12]，将菌丝抑制率和孢子萌发抑制率进行极差化处理，按照公式（4）进行转换。

式中：xi为第i个评价指标；xi′为转换后的评价指标；M、m分别为该指标中最大值、最小值。endprint

（2）评价指标的权重设置和转换：采用邓禄军等的方法[13]处理数据，本试验的评价指标有8个，各指标的权重ω1、ω2、…、ω8均设置为0.125，通过公式（5）将权重转换为角度，共8个数轴。

θi=360ωi。（5）

式中：θi为夹角角度，ωi为权重。转换结果如表2所示。

（3）雷达图的绘制：将无量纲化处理数据投影在对应的评价指标数轴上，数轴取值范围设定为[1，0]。连线形成雷达图，即可对参试样品进行直观的评价。

2 结果与分析

2.1 中药提取液浸出物的含量和提取率

由表3可知，比较不同提取剂提取7种中药的提取率发现，中药的种类和提取剂的选择对提取率有明显的影响。从中药种类方面来看，各中药提取液的提取率之间差异明显，黄芩的水溶液提取率最高，极显著高于其他中药提取液（P<001）；白芍的乙醇提取液提取率最低，极显著低于其他中药提取液（P<0.01），这说明不同中药种类的提取率不同。从不同提取剂方面来看，与乙醇作为提取剂时相比，以水作为提取剂的提取率普遍较高；除了肉桂和桑白皮外，其他中药水提取液的提取率均极显著高于乙醇提取液的提取率（P<001），这说明中药中的水溶性成分较多，脂溶性成分较少，但2类成分对抑菌作用的贡献程度还取决于2种提取液的抑菌效果。

2.2 不同中药提取液的抑菌活性比较

2.2.1 不同提取方式对中药提取液抑菌活性的影响 当中药提取液与培养基按1 ∶ 9混合时，即有效物质浓度为10%时，测定各中药的水提取液对供试菌株菌丝的抑制效果。由图1可知，各种中药水提取液对4种病菌的抑制效果差异明显。

由图1-a可知，黄连、白芍和黄柏的水提取液对灰葡萄孢菌菌丝的抑制效果较佳，抑制率分别为75.36%、78.26%、75.36%，均极显著高于其他中药水提取液的抑制率（P<0.01），肉桂、半夏水提取液对灰葡萄孢菌菌丝的抑制率分别为 52.17%、53.62%，均极显著高于黄芩和桑白皮水提取液对灰葡萄孢菌菌丝的抑制率（P<0.01），而黄芩水提取液对灰葡萄孢菌菌丝的抑制率极显著高于桑白皮水提取液的抑制率（P<0.01）。

由图1-b可知，黄连水提取液对尖孢镰刀菌菌丝的抑制效果最好，抑制率达73.02%，白芍和黄柏水提取液的抑制效果次之，抑制率分别为34.92%、33.33%，黄芩水提取液对尖孢镰刀菌菌丝的抑制效果最差，抑制率仅为4.76%，极显著低于白芍、黄柏提取液的抑制率（P<0.01）。

由图1-c可知，黄连水提取液对极细链格孢菌菌丝的抑制效果最佳，抑制率达75.36%，与黄柏水提取液的抑制率差异极显著（P<0.01），肉桂、黄芩、白芍和桑白皮水提取液对极细链格孢菌菌丝的抑制率极显著低于黄柏水提取液（P<001），抑制率分别为27.54%、21.74%、27.54%、23.19%，半夏水提取液对极细链格孢菌菌丝的生长具有促进作用。

由图1-d可知，半夏和黄柏水提取液对草酸青霉菌菌丝的抑制效果最佳，抑制率分别为53.97%、50.79%，与黄芩、桑白皮水提取液的抑制率差异极显著（P<0.01），后两者均为28.57%，黄芩、桑白皮水提取液对草酸青霉菌菌丝的抑制率均极显著高于肉桂、黄连、白芍水提取液的抑制率（P<001）。

由表4可知，7种中药的乙醇提取液对供试病原菌菌丝生长的抑制率均为100%，要了解这几种中药乙醇提取液抑菌效果的差异，还须降低乙醇提取液的浓度做进一步的比较研究。结合表3综合分析来看，虽然水提取比乙醇提取具有更高的提取率（除肉桂和桑白皮以外），但是在同等浓度下，中药乙醇提取液的抑菌能力显著优于水提取液，同时乙醇作为浸提溶剂，具有易过滤、易浓缩、易保存等优点，因此采用乙醇作为提取剂更好。

2.2.2 不同中药的乙醇提取液对4种病原菌的抑菌活性分析 当中药提取液与培养基按1 ∶ 49混合时，即有效物质浓度为2%时，测定各中药乙醇提取液对供试菌的抑制效果。

由图2、图3可知，不同中药乙醇提取液对4个菌株的菌丝和孢子的抑制效果差异明显。

由图2-a可知，黄芩和桑白皮乙醇提取液对灰葡萄孢菌菌丝的抑制率差异不显著，分别为75.97%、70.13%，均与肉桂乙醇提取液的抑制率差异极显著（P<0.01）。白芍乙醇提取液对灰葡萄孢菌丝的抑制率为19.48%，与肉桂、黄柏、半夏乙醇提取液的抑制率差异极显著（P<0.01），黄柏、半夏乙醇提取液的抑制率之间差异不显著，分别为1.3%、0.65%。

由图2-b可知，肉桂乙醇提取液对尖孢镰刀菌菌丝的抑制率最高，为100%，极显著高于其他中药乙醇提取液的抑制率 （P<0.01）， 黄芩乙醇提取液对尖孢镰刀菌菌丝的抑制率次之，为61.73%，黄芩、桑白皮、白芍乙醇提取液的抑制率之间差异极显著（P<0.01），但均极显著高于黄连、黄柏、半夏乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后三者之间差异不显著，分别为5.56%、1.23%、6.17%。

由图2-c可知，肉桂、桑白皮乙醇提取液对极细链格孢菌菌丝的抑制率差异不显著，分别为77.78%、80.95%，均极显著高于其他几种中药乙醇提取液对极细链格孢菌菌丝的抑制率（P<0.01），且其他几种中药乙醇提取液对极细链格孢菌菌丝的抑制率之间差异极显著（P<0.01）。

由图2-d可知，不同中药乙醇提取液对草酸青霉菌菌丝的抑制率表现为肉桂>黄芩>桑白皮>半夏>黄柏>黄连>白芍，除桑白皮与半夏、黄柏与黄连的乙醇提取液对草酸青霉菌菌丝的抑制率之间差异不显著外，其他中药乙醇提取液的抑制率之间的差异均达到极显著水平（P<0.01）。

由图3-a可知，肉桂、黄芩中药乙醇提取液对提取液对灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制率均为100%，极显著高于其余几种中药乙醇提取液对灰葡萄孢菌孢子的抑制率，半夏乙醇提取液对灰葡萄孢菌孢子的抑制率显著高于黄连乙醇提取液（P<0.05），但二者与白芍乙醇提取液的抑制率无差异，与桑白皮乙醇提取液的抑制率之间的差异达到极显著水平（P<0.01），黄柏乙醇提取液对灰葡萄孢菌孢子的萌发几乎无抑制效果，抑制率仅为0.18%，与黄连乙醇提取液的抑制率差异不显著，而与半夏乙醇提取液的抑制率差异极显著（P<001）。endprint

由图3-b可知，桑白皮乙醇提取液能够完全抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发，肉桂乙醇提取液对其抑制率达93.66%，两者之间差异显著（P<0.05），黄芩乙醇提取液对尖孢镰刀菌孢子的抑制率为81.92%，与肉桂乙醇提取液对尖孢镰刀菌孢子的抑制率差异显著（P<0.05），其余中药乙醇提取液对尖孢镰刀菌孢子的抑制率均极显著低于黄芩乙醇提取液对尖孢镰刀菌孢子的抑制率（P<0.01），且相互之间差异极显著（P<0.01），表现为黄柏>半夏>黄连>白芍。

由图3-c可知，肉桂、黄连、半夏乙醇提取液对极细链格孢菌孢子萌发的抑制率均为100%，极显著高于黄芩、桑白皮乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后二者分别为87.01%、877%，黄芩、桑白皮乙醇提取液的抑制率极显著高于黄柏、白芍乙醇提取液的抑制率（P<0.01），且黄柏、白芍乙醇提取液的抑制率之间差异极显著（P<0.01）。

由图3-d可知，肉桂、黄芩乙醇提取液均能够完全抑制草酸青霉菌孢子的萌发，且两者的抑制率极显著高于黄连、黄柏、桑白皮乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后三者的抑制率之间的差异也达到极显著水平（P<0.01），分别为90.54%、70.03%、49.37%。白芍、半夏提取液的抑制率分别为 0.24%、9.91%，两者差异显著（P<0.05）。

由于评价指标较多，且各中药的指标有高有低，不能直观判定抑菌活性的相对大小，因此采用雷达图法进一步进行分析。

2.2.3 雷达图法比较抑菌活性 将图2、图3中的各评价指标进行无量纲化处理，并绘制雷达图，结果分别如表5、图4所示。由于采用了极差化的无量纲处理方法，数轴上取值范围为[0，1]，离原点越远，代表在同一指标比较中，抑制效果相对越好；离原点越近，抑制效果相对越差。

由图4可知，半夏乙醇提取液有着明显的专一性抑菌倾向，只对极细链格孢有抑制效果，其中，半夏乙醇提取液能够完全抑制极细链格孢菌孢子的萌发，桑白皮乙醇提取液对极细链格孢菌菌丝生长的抑制率大于80%；黄芩的指标1、指标5、指标8的值均为1，表明黄芩乙醇提取液对灰葡萄孢菌菌丝的生长和孢子的萌发的抑制率均为100%；而黄连乙醇提取液则表现为明显的选择性抑菌偏向，黄连指标7、指标8的值均大于90%，表明黄连乙醇提取液能够有效抑制尖孢镰刀菌、草酸青霉菌孢子的萌发；肉桂乙醇提取液基本能够完全抑制4种病菌孢子的萌发和菌丝的生长，无明显的抑菌偏向。

2.3 肉桂乙醇提取液的抑菌能力测定

通过以上分析得出肉桂乙醇提取液的抑菌效果最佳，但是其抑菌所需的具体浓度尚不明确，因此对其抑菌所需浓度进行测定。

由表6可知，肉桂乙醇提取液的抑菌所需浓度较低，且对尖孢镰刀菌和草酸青霉菌的抑制效果较强，EC50分别为 0.20、0.21 g/L，当肉桂乙醇提取液的浓度为0.45 g/L时，理论上，对2种菌的抑制率达90%。肉桂乙醇提取液对灰葡萄孢菌的抑制能力最低，其EC50为1.09 g/L，若要达到90%的抑制效果，其浓度须达到2.25 g/L；理论上，当肉桂乙醇提取液的浓度为2.25 g/L时，可以完全抑制尖孢镰刀菌、极细链格孢菌、草酸青霉菌的生长，对灰葡萄孢菌的抑制率达90%。因此，可将肉桂乙醇提取液作为一种广谱的番茄病害防治植物源抑菌剂加以开发利用。

3 讨论

在提取过程中，虽然水提取比乙醇提取具有更高的提取率（肉桂除外），但乙醇提取液的抑菌活性优于水提取液，说明中药中的水溶性成分较多，但起主要抑菌作用的可能是一些脂溶性成分；半夏和白芍2种中药乙醇提取液只对极细链格孢菌有抑制效果，二者配合可作为专一性抑菌剂加以开发利用，对番茄假黑斑病的防治有一定的应用价值，黄芩乙醇提取液对灰葡萄孢菌菌丝的生长和孢子的萌发的抑制率均为100%，可作为灰葡萄孢菌的专一性抑菌剂加以开发利用，对番茄黑霉病的防治有一定的应用价值；理论上，当肉桂乙醇提取液的浓度达到 2.25 g/L 时，对4株供试菌的生长均具有良好的抑制效果，因此，肉桂对番茄病害的防治具有一定的应用价值， 可以直接利用或研究其有效抑菌成分作为新型植物源抑菌剂加以开发利用。

本试验采用雷达图法综合分析了多个指标，可以从大量数据中快速筛选出部分表现优秀的样品组，具有简洁和直观的优势，并且可以应用于食品风味、质量评价等多指标评价。但是由于指标排列顺序的不同会使图形出现一定差别，因此只能用于快速筛选，而无法进一步比较寻找最优的样品组，限制了其应用。

本试验仅对中药的抑菌活性做了初步研究，而中药成分比较复杂[14]，抑菌作用可能是多种成分共同作用的结果，且抑菌活性可能与供试样品的生长地域、生长季节等诸多因素有关，想要分析其具体抑菌成分，还须进一步深入研究。

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