贵州猕猴桃溃疡病病菌分离鉴定及其培养特性

龙云川+彭熙+李苇洁+刘曼+万合锋+任春光

摘要：以贵州省猕猴桃基地内猕猴桃感病组织为材料，采用组织分离法分离纯化获得1株病原菌菌株，并从形态、生理生化、16S rDNA序列对其进行鉴定，进一步研究该菌株在不同培养条件下的生长情况。结果表明，通过致病性测定及形态、生理生化、16S rDNA分析，明确该菌株为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidae）；培养基种类、pH值、温度会对病原菌的生长产生一定影响，菌株生长相对最适培养基为Luria-Bertani（LB）培养基，最适培养条件为pH值7.5、温度15 ℃。

关键词：猕猴桃；溃疡病；丁香假单胞菌；培养特性；16S rDNA

中图分类号： S436.634.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0114-03

猕猴桃享有水果之王、世界珍果之美誉，维生素C含量丰富，是等质量苹果的20～80倍[1]。据统计，世界猕猴桃栽培面积约20万hm2，而我国猕猴桃栽培面积占世界份额已超过50%[2]。猕猴桃溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性细菌性病害，来势凶猛，具有传播快、致病性强、范围广、防治难度大等特点[3]，1996年被列为全国森林植物检疫对象，2009年国家質量监督检验检疫总局将其列入禁止入境的有害生物名单，2013年国家林业局将其视为林业危险性有害生物[4]。

贵州是我国猕猴桃分布中心之一，在修文、六盘水、瓮安等地有大规模种植[5]。近年来，随着猕猴桃种植面积的扩大及对外引种频繁，猕猴桃溃疡病有蔓延趋势[6]。2014—2015年春，对贵州省各猕猴桃基地调查发现，部分果园有溃疡病零星发生，科学预防控制猕猴桃溃疡病害的发生、发展，对猕猴桃产业及食品安全至关重要。植物病原菌在侵染传播过程中，其菌株易发生变异分化[7]，而病原菌的培养特性是病原菌致病机理、病害流行及防治研究的基础[8]，贵州省尚无对猕猴桃溃疡病菌分离和其培养特性系统研究的报道。本试验从猕猴桃感病组织分离得到病原菌，并对该菌株进行生理生化和分子鉴定，研究菌株在不同培养基种类、pH值、温度、光照等条件下的培养性状，以期摸清猕猴桃溃疡病田间发生和流行规律，为其科学防控提供参考与指导。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

2015年3—4月，在贵州六枝特区、修文县等猕猴桃产业园内选择具有代表性的猕猴桃栽培地，根据发病情况和受害程度采集典型标本带回实验室鉴定。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，酵母膏10 g，水1 000 mL，pH值7.2；SPA培养基[9]：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；肉汁胨（BPA）培养基[10]：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母膏1 g，水1 000 mL，pH值7.0。琼脂固体培养基在此基础上添加1.8%琼脂。

1.3 病原菌分离

取猕猴桃感病组织制片，在德国Carlzeiss生产的Laboval-4型显微镜下进行镜检，检查有无菌丝、子实体、孢子、菌核、菌索、病原线虫虫体、虫卵等，判定病原是否为真菌或线虫；将感病组织用无菌水冲洗，用75%乙醇擦拭；超净台上用无菌手术刀片在病健交界处切取5 mm见方的小块，用75%乙醇消毒20 s；无菌水冲洗3遍，接种于PDA、牛肉膏蛋白胨培养基上恒温培养，重复3次，以猕猴桃基地健康植株组织为空白对照。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 致病性测定 将纯化后的菌株配成108 CFU/mL菌液，采用针刺法对猕猴桃健康叶片进行离体接种；将接种的叶片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，30 ℃恒温培养箱中培养，定期观察并记录发病情况[6]。

1.4.2 菌株形态及生理生化特征观察 用平板划线法[11]将菌种接种于平板培养基上，30 ℃培养24 h，从菌落大小、形状、边缘、光泽、质地、透明程度及培养基颜色等进行观察。参照《常见细菌系统鉴定手册》《伯杰细菌鉴定手册》开展接触酶试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P）试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、碳源利用试验等，对菌株进行生理生化鉴定[12-13]。

1.4.3 分子生物学鉴定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司的SK8255试剂盒操作说明提取基因组DNA。扩增16S rDNA序列片段采用16S rRNA基因通用引物，上游引物为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物为：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用50 μL PCR反应体系：10×Taq buffer（15 mmol/L MgCl2）5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L） 4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O补足50 μL。PCR循环反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离检测、染色、凝胶成像，送宝生物工程（大连）有限公司测定序列，并与NCBI数据库做Blast分析；采用Clustal X软件将序列与标准菌株片段进行比对，运用Mega 5.2软件采用Neighbor Joining方法构建系统发育树，分析其亲缘关系。endprint

1.5 病原菌培养特性

菌株在BPA液体培养基中活化24 h，按1%的接种量分别将培养菌液接种于50 mL pH值为7.0的不同种类液体培养基、不同pH值的BPA培养基中，30 ℃ 150 r/min无光照培养24 h，用分光光度计测定波长为600 nm时的吸光度（D600 nm），同时研究菌株在pH值为7.0的BPA培养基中不同光照、不同温度对其生长的影响。按1%的接种量将菌液接种于优势培养基中，在优化培养条件下振荡培养，每隔3 h取样测定D600 nm；以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。所有测定重复3次。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及形态特征

试验结果表明，从多个感病组织（图1）均可分离出菌落形态一致的菌落，而健康组织未分离出菌株；将菌株挑出，纯化，制成菌液，用针刺法对猕猴桃新鲜健康叶片进行接种，叶片出现褐色病斑，而接种无菌水的猕猴桃叶片正常，说明该菌株R01有致病性；致病菌菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色、圆形、光滑、半透明、生长缓慢、表面湿润黏稠、易挑取；革兰氏染色为阴性，镜检发现该病原菌的菌体为直杆状或短杆状，有的稍弯曲，大小为（1.2～2.4） μm×（0.2～0.5）μm，两端钝圆，单生（图2）。

2.2 病原菌生理生化鉴定

试验结果表明，分离出的菌株接触酶试验、过氧化氢酶试验均表现为阳性，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖；吲哚试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、氧化酶、淀粉水解试验、明胶液化试验均表现为阴性，不能利用海藻糖、麦芽糖。

2.3 分离菌株16S rRNA基因序列分析

病原菌菌株16S rDNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果由图3可见，菌株R01的特异性片段大小约为1.5 ku；DNA提取效果相对较好，可用于16S rDNA序列测定分析。16S rRNA测序结果在GenBank数据库中的登录号为KU543670，经Blast分析显示，菌株R01序列与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种菌株AB001439.1相似度为99%。由图4可见，分离菌株R01与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种处于同一分支上，亲缘关系相对较近，同源性相对较高。

因此，可确定本试验分离的猕猴桃溃疡病病原菌株为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidae）。

2.4 分离菌株的培养特性

试验结果表明，菌株R01在不同培养基中的生长差异较大，其中，在SPA、LB培养基中生长相对较好，在PDA培养基中生长相对最差（图5）；菌株生长的最适pH值为7.5；pH值为6.5～8.0时，菌株也可保持较为旺盛的生长能力（图6）；菌株的最适生长温度为15 ℃，温度较低或较高菌株的生长均较为缓慢，当培养温度超过25 ℃时，吸光度D600 nm大幅降低，说明此时随温度升高，细菌的生长受到抑制（图7）；研究连续黑暗、光照12 h—黑暗12 h、连续光照3种方式对菌株生长的影响发现，光照对丁香假单胞杆菌的生长没有显著影响。由图8可见，菌株R01刚开始培养时生长缓慢；培养6～9 h，菌株进入指数期快速生长；培养24 h后，菌株生产进入稳定期，其吸光度D600 nm值稳定在1.80左右。

3 结论与讨论

对贵州省六枝特区、修文县等地的猕猴桃溃疡病病原菌进行分离，在完成致病性鉴定的基础上，分离到病原菌菌株R01；菌株R01经形态、生理生化及16S rDNA序列分析，明确该菌株为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidae），与赵利娜等的研究结论[10，14-17]一致，这也说明猕猴桃溃疡病在侵染传播过程中其病原菌没有发生明显的变异分化。菌株R01能在5～30 ℃温度条件下生长，其中最适生长温度为15 ℃；在pH值为6.5～8.0的培养基中也生长较好，而最适pH值为7.5；SPA、LB培养基是菌株R01较为适合的培养基。通过长期田间观察发现，猕猴桃溃疡病田间最适发病温度为12～16 ℃，当温度达到25 ℃以上，田间几乎不发病，而本研究的病原菌生长最适温度与田间最适发病温度基本一致，这与李黎等的研究结论[3，10，15]较为一致。

由于引起田间发病的因素较为复杂，是多因素共同作用的结果，本试验仅考虑病原菌的生长快慢，今后应加强该病的致病机理、致病菌与植物互作机制、病原菌次生代谢物等方面的深入研究，为猕猴桃溃疡病的综合防治提供科学的理论依据。

参考文献：

[1]黄 诚，周长春，李 伟. 猕猴桃的营养保健功能与开发利用研究[J]. 食品科技，2007，32（4）：51-55.

[2]高小宁，赵志博，黄其玲，等. 猕猴桃细菌性溃疡病研究进展[J]. 果树学报，2012，29（2）：262-268.

[3]李 黎，钟彩虹，李大卫，等. 猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展[J]. 华中农业大学学报，2013，32（5）：124-133.

[4]邵宝林，王成华，刘露希，等. 猕猴桃溃疡病生防芽孢杆菌B2的鉴定及应用[J]. 中国农学通报，2015，31（26）：103-108.

[5]黄 伟，万明长，乔 荣. 贵州猕猴桃产业发展现状与对策[J]. 贵州农业科学，2012，40（4）：184-186.

[6]任春光，刘 曼，李安定，等. 贵州猕猴桃病害的种类调查及防治

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建议[J]. 中国森林病虫，2015，34（1）：23-25.

[7]崔朝宇，张超群，周泽科，等. 烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定[J]. 生物灾害科学，2012（2）：153-156.

[8]程艳辉，曹远银，张 晶，等. 稻曲病菌培养条件的优化[J]. 河南农业科学，2011，40（5）：120-123.

[9]Fahy P，Persley G. A diagnostic guide[M]. Australia：Academic Press，1983：107-374.

[10]赵利娜，胡家勇，叶振风，等. 猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定[J]. 华中农业大学学报，2012，31（5）：604-608.

[11]Wang S，Gong X，Zhou S，et al. The isolation and identification of ginger blast pathogen and screening of its antagonistic fungus[J]. Journal of Hunan Agricultural University，2014，39（3）：282-285.

[12]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：370-410.

[13]Boone D R，Castenholz R W，Garrity G M. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. New York：Springer，2001：217-289.

[14]張慧琴，毛雪琴，肖金平，等. 猕猴桃溃疡病病原菌分子鉴定与抗性材料初选[J]. 核农学报，2014，28（7）：1181-1187.

[15]王忠肃，唐显富，刘绍基. 猕猴桃细菌溃疡病（actinidia bacterial canker）病原细菌鉴定[J]. 西南大学学报（自然科学版），1992，14（6）：500-503.

[16]邵宝林，刘 瑶，朱天辉，等. 猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究[J]. 植物病理学报，2013，43（5）：458-466.

[17]黄其玲，高小宁，赵志博，等. GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性及其在土壤、根系中的定殖[J]. 中国农业科学，2013，46（2）：282-291.endprint