过氧化氢浸种处理对油菜幼苗抗寒生理特性的影响

叶朝军+万林+孙继+金渊博+王怡娟+江海东

摘要：以南农油4号（Brassica napus cv. Nannongyou 4）油菜品种为试验材料，研究0.05%浓度过氧化氢（H2O2）浸种处理对低温下油菜幼苗活性氧、抗氧化酶系统和非酶抗氧化剂的影响。结果表明，0.05%浓度过氧化氢浸种能够有效降低丙二醛（MDA）含量，在胁迫后期（大于3 d），H2O2处理下的油菜叶片H2O2含量和 O-2 · 产生速率均显著低于对照。抗氧化酶活性的数据表明，H2O2浸种处理能有效提高逆境胁迫下油菜叶片中的抗氧化酶活性，以处理6 d为例，油菜叶片的SOD、POD、CAT活性分别提高了29.8%、21.0%、50.3%；另外，H2O2浸种处理后油菜的AsA、GSH含量，AsA/DHA和GSH/GSSG也有显著增加。由此可见，过氧化氢浸种处理可缓解低温对油菜的伤害。

关键词：油菜；过氧化氢；浸种；低温胁迫；抗氧化系统

中图分类号： S634.301 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0104-03

油菜是我國长江中下游地区主要的油料作物，其种植面积和总产均居世界首位[1]。近年来，直播油菜以其省工节本的优点受到广大农民的欢迎。但由于耕作制度的改变或茬口的原因等，往往播种较晚，出苗后容易遭受低温冻害，引起代谢紊乱而影响油菜生长[2]。因此研究和防治冷害对油菜的影响意义重大。

植物在正常生长情况下，体内活性氧（ROS）的产生与清除处于一种动态平衡。而在低温胁迫条件下植物体内膜脂过氧化进程加快，ROS的代谢紊乱，积累的ROS会对植物造成毒害作用[3-4]。植物体内清除ROS的系统有抗氧化酶类及非酶抗氧化剂等物质，这些物质协同作用能有效清除ROS，保护膜的完整性，提高植物抗寒性。植物体内的抗氧化系统由小分子抗氧化物和抗氧化酶组成[5]。侯丽霞研究发现用适宜浓度双氧水（H2O2）喷施油菜叶片提高了油菜的抗寒性[6]。浸种是生产上一种常用的药剂处理方式，周筱玲研究表明，H2O2浸种能显著提高油菜种子发芽率[7]。万林等研究表明，H2O2浸种能有效缓解低温胁迫对苗期油菜生长的抑制效应[8]。

总体来看，目前H2O2浸种对油菜抗寒生理研究较为薄弱。万林等试验在大田进行，温度波动较大[8]。因此，本试验以抗寒性品种南农油4号为试验材料，研究其经过H2O2浸种处理后，苗期油菜在低温胁迫下叶片中ROS含量、抗氧化酶活性及抗氧化物质含量的变化，以期为油菜的抗寒栽培提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试油菜品种为南农油4号（Brassica napus cv. Nannongyou 4）。2013年10月28日，以筛选出的质量浓度为0.05%的H2O2于黑暗下浸泡油菜种子8 h，以去离子水浸种作为对照。浸种完成后用去离子水漂洗3次后晾干，播于规格为7 cm×7 cm×5 cm 的小花盆中，培养基质为沙土（1 ∶ 1混合）。置于（20.0±1.0） ℃/（15.0±1.0） ℃光照培养箱中培养，油菜苗长出真叶时定苗，待油菜长出3张真叶开始进行低温胁迫。设置光照培养箱内温度为4.0±1.0 ℃，连续胁迫9 d，每个处理重复3次。测量时，从3个重复处理中选取生长一致的5株幼苗，每株幼苗均以自上而下第3张真叶作为测量对象。

1.2 测定方法

H2O2含量测定参照Moloi等的方法[9]；丙二醛（MDA）含量测定参照Hodges等的方法[10]；超氧阴离子自由基（O-2 · ）产生速率测定参照Elstner等的方法[11]并有所改动。取 0.5 mL 的粗酶液、0.5 mL的65 mmol/L磷酸缓冲液（pH值为7.8）、1 mL的10 mmol/L磺胺和1 mL的7 mmol/L的α-萘胺，摇匀后 25 ℃ 水浴20 min。在530 nm条件下测定其吸光度。超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化物酶（POD）活性测定参照Tan等的方法[12]；过氧化氢酶（CAT）活性测定主要是参照Chance等的方法[13]并有所修改。0.1 mL酶液加 3 mL CAT反应液（0.075% H2O2溶液1 mL，0.05 mol/L pH值7.0的磷酸缓冲液1.9 mL），240 nm下比色，每隔30 s读取吸光度的下降值。抗坏血酸（AsA）及脱氢抗坏血酸（DHA）含量参照Khanna-Chopra等的方法[14]提取测定；谷胱甘肽还原型（GSH）和氧化型（GSSG）含量参照Paradiso等的方法[15]测定。以上测量均在南京农业大学植物生理实验室测量完成。

1.3 数据分析与作图

每个测量数据均5次重复，取其平均值。采用Excel 2010作图，运用SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 油菜叶片MDA含量的比较

从图1可以看出，随着胁迫时间延长，对照油菜MDA含量呈上升趋势，而H2O2处理油菜MDA含量呈先降后升的趋势。在胁迫期间，H2O2处理油菜MDA含量均低于对照。在胁迫3、6、9 d，H2O2处理下MDA含量比对照分别减少了269%、23.7%、11.4%。

2.2 油菜叶片H2O2含量和O-2 · 产生速率的比较

O-2 · 和H2O2是植物体内2类重要的活性氧。图2显示，对照和H2O2处理油菜叶片中的 O-2 · 产生速率和H2O2含量均随胁迫时间的延长而明显上升。在胁迫初期（3 d时），H2O2处理下的油菜叶片H2O2含量高于对照处理，这可能是由于H2O2浸种处理使油菜提前进入氧化胁迫阶段，而在胁迫后期（9 d时），H2O2处理下的油菜叶片H2O2含量和 O-2 · 产生速率均显著低于对照。

2.3 油菜幼苗SOD、POD、CAT活性比较endprint

SOD、POD和CAT是植物体内重要的3类抗氧化酶。由图3可以看出，H2O2浸种处理可提高低温胁迫下这3类酶的活性。与对照相比，在低温胁迫6 d，油菜叶片的SOD、POD、CAT活性分别提高了29.8%、21.0%、50.3%，说明H2O2浸种处理能有效提高逆境胁迫下油菜叶片中的抗氧化酶活性，从而提高其抗寒性，缓解低温对油菜的伤害。

2.4 油菜叶片AsA和GSH的比较

AsA和GSH是植物体内重要的抗氧化剂，通过AsA-GSH循环发挥作用。由图4可以看出，在低温胁迫期间，AsA含量呈上升趋势，GSH含量呈先升后降的趋势。整体而言，H2O2浸种处理的油菜AsA、GSH含量高于对照油菜。在低温胁迫6 d，H2O2浸种处理的油菜AsA、GSH含量分别比对照高出16.4%、28.7%。

另外，植物体内除氧化态的AsA、GSH外，还存在着还原态的DHA和GSSG。AsA/DHA和GSH/GSSG更能体现植物整体的氧化还原状况。从图4可以看出，AsA/DHA、GSH/GSSG的比值均随胁迫时间的延长先上升后趋于稳定。整体而言，H2O2浸种处理的油菜AsA/DHA和GSH/GSSG均高于對照油菜。在低温胁迫 9 d，H2O2浸种处理的油菜AsA/DHA和GSH/GSSG分别比对照高出15.6%、15.8%。

3 讨论

研究发现，在胁迫初期，H2O2浸种处理的油菜叶片MDA含量和O-2 · 产生速率均下降，而随着胁迫程度的加重，叶片的MDA含量及ROS水平迅速增加[6]。其变化趋势说明植物叶片对低温胁迫有一个适应过程，胁迫程度加重时，植物体内清除ROS的能力下降，植物受到氧化伤害。同时也说明H2O2浸种能在一定程度上有效缓解低温胁迫下油菜叶片ROS的大量积累，减少膜伤害。徐田军等的研究结果[16]也证实了该结论。本试验结果表明，在胁迫3、6、9 d，H2O2处理下MDA的含量比对照分别减少了26.9%、23.7%、 11.4%。另外，在胁迫后期（9 d时），H2O2处理下的油菜叶片H2O2含量和O-2 · 产生速率均显著低于对照。说明前期H2O2浸种处理可对低温胁迫下的幼苗后期生长起到一定的保护作用。

植物受到低温胁迫后，其体内的抗氧化酶系统就会得到加强[17]，这是保护植物不受氧化胁迫的抗逆性机制之一[18]。SOD、POD和CAT作为植物细胞主要的保护酶，协调作用共同清除植物体内活性氧。万林等研究发现，H2O2浸种处理极大地促进了低温下油菜叶片中的POD、CAT活性的提高，使得植物体内多余的活性氧被迅速清除，降低了MDA含量，以减少膜伤害[8]；吕军芬等发现H2O2浸种处理能显著提高低温胁迫下西瓜（Citrullus lanatus）叶片的SOD活性[19]。本试验结果表明，低温胁迫下油菜叶片的SOD、POD活性呈先升后下降的趋势，而CAT的活性呈一直下降的趋势。这可能是由于CAT对低温胁迫的反应与POD、SOD略有不同，CAT对低温胁迫比较敏感。与对照相比，H2O2浸种处理显著提高了油菜幼苗叶片中SOD、POD、CAT活性。结合MDA、H2O2含量，以及O-2 · 产生速率可以推断，前期（小于3 d）的低温胁迫是一个抗寒锻炼的过程。随着胁迫程度的增强，细胞膜抗氧化系统遭到破坏。

AsA和GSH是植物体内重要的非酶抗氧化剂。在防止细胞膜过氧化、保持细胞膜系统的完整性、延缓细胞的衰老和增强植物抗逆性方面发挥着重要功能[20]。本试验结果表明，在胁迫初期，AsA含量随着幼苗的生长而上升，而GSH含量则先升高后下降。H2O2处理的ASA含量均一直显著高于对照；处理后期（≥6 d时），H2O2处理的GSH含量也显著高于对照。这说明H2O2浸种能提高ASA、GSH含量，以减轻油菜的膜脂过氧化，增强其耐寒性。这与小麦（Triticum aestivum）[21]、草莓（Fragaria×ananassa）[22]等的研究相一致。

综上所述，低温胁迫下，H2O2浸种处理能够通过降低MDA含量、ROS水平以及提高抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、增加非酶抗氧化剂（AsA、GSH）含量来提高油菜抗寒性，缓解低温胁迫伤害。尽管本研究没有涉及外源H2O2处理对油菜后期生长和产量的影响，但外源H2O2处理有助于低温胁迫下油菜苗期的生长发育，必然可以增加油菜生物量的积累，从而减少低温造成的产量损失。

参考文献：

[1]张冬晓. 我国油菜生产的发展与展望[J]. 中国油料作物学报，2001，23（4）：79-81.

[2]周 琴，孙小芳，郭月玲，等. 6-BA和PP333对油菜幼苗抗寒性的影响[J]. 中国油料作物学报，2007，29（3）：286-290.

[3]朱惠霞，孙万仓，邓 斌，等. 白菜型冬油菜品种的抗寒性及其生理生化特性[J]. 西北农业学报，2007，16（4）：34-38.

[4]蒲媛媛，孙万仓. 白菜型冬油菜抗寒性与生理生化特性关系[J]. 分子植物育种，2010，8（2）：335-339.

[5]陈 超. 低温条件下冬小麦糖代谢和抗氧化活性与耐寒性关系[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2014.

[6]侯丽霞. H2O2对低温下油菜幼苗几个生理指标的影响[J]. 湖北农业科学，2013，52（21）：5144-5146.

[7]周筱玲. H2O2浸种对油菜种子萌发的影响[J]. 九江师专学报（社会科学版），1997，15（6）：32-35.

[8]万 林，张 曼，钟飞燕，等. H2O2浸种对晚播油菜苗期耐寒性的影响[J]. 中国油料作物学报，2015，37（6）：811-819.

[9]Moloi M J，van der Westhuizen A J. The reactive Oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid[J]. Journal of Plant Physiology，2006，163（11）：1118-1125.endprint

[10]Hodges D M，Delong J M，Forney C F，et al. Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J]. Planta，1999，207（4）：604-611.

[11]Elstner E F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells[M]//Pelland E J，Steffen K L. Active oxygen/oxidative stress in plant metabolism. Rockville：American Society of Plant Physiologists，1991：13-25.

[12]Tan W，Liu J，Dai T，et al. Alterations in photosynthesis and antioxidant enzyme activity in winter wheat subjected to post-anthesis water-logging[J]. Photosynthetica，2008，46（1）：21-27.

[13]Chance B，Maehly A C. Assay of catalases and peroxidases[J]. Methods in Enzymology，1955，2：764-775.

[14]Khanna-Chopra R，Selote D S. Acclimation to drought stress generates oxidative stress tolerance in drought-resistant than -susceptible wheat cultivar under field conditions[J]. Environmental and Experimental Botany，2007，60（2）：276-283.

[15]Paradiso A，Berardino R，de Pinto M C，et al. Increase in ascorbate-glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants[J]. Plant and Cell Physiology，2008，49（3）：362-374.

[16]徐田軍，董志强，兰宏亮，等. 低温胁迫下聚糠萘合剂对玉米幼苗光合作用和抗氧化酶活性的影响[J]. 作物学报，2012，38（2）：352-359.

[17]刘玉凤，李天来，高晓倩. 夜间低温胁迫对番茄叶片活性氧代谢及AsA-GSH循环的影响[J]. 西北植物学报，2011，31（4）：707-714.

[18]张立军，宋广周，白 霜，等. H2O2对不同大豆品种低温萌发及主要抗氧化酶活性的影响[J]. 大豆科学，2008，27（1）：97-100.

[19]吕军芬，郁继华. H2O2浸种对西瓜耐冷性生理生化指标的影响[J]. 甘肃农业科技，2004（4）：30-32.

[20]许 英，陈建华，朱爱国，等. 低温胁迫下植物响应机理的研究进展[J]. 中国麻业科学，2015（1）：40-49.

[21]郭丽红，王定康，王德斌，等. 抗坏血酸和谷胱甘肽在小麦幼苗冷激诱导抗冷性中的变化[J]. 昆明学院学报，2007，29（4）：66-68.

[22]罗 娅. 低温胁迫与锻炼对草苟生理特性的影响和草每几丁质酶基因的克隆[D]. 雅安：四川农业大学，2007.endprint