2种蛋白质组学方法在石榴中的应用比较

曹尚银+牛娟+张杰+李好先+薛辉+陈丽娜+刘蓓蓓+张富红+赵第广

摘要：对蛋白质组学中的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，简称2-DE）、相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantification，简称iTRAQ）2种技术进行比较，以期为石榴的蛋白质组学研究提供选择参考。取花后120 d的三白石榴籽粒为材料，分别用双向电泳、iTRAQ 2种技术检测三白石榴籽粒蛋白。结果表明，利用2-DE技术检测到890种蛋白；通过质谱鉴定出5种蛋白；利用iTRAQ技术得到1 940种蛋白，其中分子量在10 ku以下的有16种，200 ku以上的有19种，pH值大于11的有11种，说明iTRAQ技术在鉴定大分子、小分子蛋白方面具有优势。由以上结果可知，iTRAQ技术比2-DE技术能发现更多数量、更多种类的蛋白，而且iTRAQ技术可以通过信息检索了解到被检索肽段的真实身份，该技术的出现，使得对同种蛋白质表达变化的鉴定更为准确。

关键词：双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）；相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）；蛋白质组学；石榴

中图分类号： Q946.1；S665.401 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0068-03

基因功能的主要执行者是蛋白质，蛋白质的研究对揭示基因的功能及生命现象的本质有重要意义。然而生命体内的蛋白质极为复杂，一般每个细胞和组织都有数千甚至上万种蛋白，因而需要一种技术能将大量蛋白同时进行分离。蛋白质组学（Proteomics）是近年来发展的新技术，是从整体水平上认识蛋白质的存在及活动方式（表达、修饰、功能、相互作用等），从而更好地阐明生命科学本质的学科[1]；蛋白质组学可以系统地研究植物体的生理生化变化，动态描述蛋白质水平的表达差异，并鉴定出与其生理生化变化相关的蛋白或基因，以分析植物不同生长时期、不同环境条件对生命过程的影响，从蛋白水平解释植物各种生理过程的分子机制[2]。因此，蛋白质组学对于果实的发育和组织器官分化、突变体以及对生物和非生物胁迫的适应机制、生理生化过程以及亚细胞结构研究等方面均有着重要的理论与实践意义。目前，蛋白质组学研究的主要方法有双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，简称2-DE）、相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，简称iTRAQ）技术。2-DE是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异，通过2次电泳达到分离蛋白质群的技术[3]。2-DE 利用不同蛋白质分子的等电点和分子量的差异，将不同等电点的蛋白质分子在第1向等电聚焦（IEF）时分离，然后不同分子量的蛋白质分子在第2向聚丙烯酰胺凝胶电泳时被分离，将复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过多年发展，目前这种方法可同时分离数千种蛋白，具有分析简便、快速、分辨率高和重复性好等优点，一直是蛋白质组学研究中应用较多的技术手段。但是，由于受到原理和技术本身的限制，双向电泳技术自诞生以来，始终存在一些难以解决的缺陷，例如2-DE仅能分离水溶性蛋白，而无法应对非水溶性蛋白或某些极端蛋白；同一样品获得的不同重复胶之间经常存在一定的误差，导致试验重复性不佳，操作繁琐，致使试验周期相对较长等[4]。傳统的双向电泳技术无法对2个蛋白质样品的差异进行检测与定量，因而不能应用于大规模的蛋白质组学分析。

由于蛋白质浓度对于蛋白功能的实现具有重要的作用，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示其细胞的突变过程。因此，对蛋白质的相对、绝对浓度进行测定就变得非常重要[5]。iTRAQ技术是美国应用生物系统公司（Applied Biosystems）（ABI）在2004年推出的一项新的体外同位素标记技术[6]。如今，该技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用，其关键是iTRAQ试剂，该试剂由3种不同的化学标签组成，即报告基团部分（质量为113、114、115、116、117、118、119、121 u）、平衡基团部分（balance group）（质量为192、191、190、189、188、187、186、184 u）和1个相同的反应基团部分（reactive group）。上述8种报告基团通过平衡基团与反应基团相连，可以同时研究8组样品[7]。因此，该技术同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。如今，iTRAQ技术已经在果树蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用，如Marsh等应用iTRAQ技术研究了白粉菌感染后的葡萄品种Cabernet Sauvignon（敏感型）的蛋白质组变化[8]。但是到目前为止，关于石榴的蛋白质组学研究较少，有关石榴果实发育和代谢相关蛋白质组学研究尚处于起步阶段，仅有软籽和硬籽石榴果皮双向电泳图谱对比分析[9]，及软籽石榴和硬籽石榴籽粒差异蛋白质组学分析[10]。本试验以三白石榴籽粒为材料，对2-DE、iTRAQ 2种技术在石榴籽粒中的蛋白鉴定效果进行比较研究，以期找出适合石榴组织或器官蛋白质组研究的方法，为石榴蛋白质组学研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以中国农业科学院郑州果树研究所石榴优良品种比较圃内7年生白皮的三白石榴（扦插苗定植）为试验材料，三白石榴为白花、白皮、白籽（硬籽），5月中下旬为盛花期，9月中下旬成熟。从石榴园中选取树体健壮、大小一致、无病虫害的9株结果树，每3株为1组，共3次重复。在大蕾期标记大小基本一致的花蕾，于9月20日取花后120 d的树冠北面中部内堂果实，迅速切取果实中部籽粒，立刻用液氮保存，然后置于 -80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2 试验方法endprint

1.2.1 双向电泳 采用三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取石榴籽粒总蛋白。称取1 g石榴种子加液氮研磨粉碎，在磨好的样品粉末中加入预冷的10% TCA-丙酮溶液（含0.1%二硫苏糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟），-20 ℃静置2 h；高速离心20 min，弃上清；将沉淀物放入冷冻真空干燥机中干燥20 min，将干燥的蛋白粉末采用Bradford法进行蛋白质定量[11]。双向电泳时蛋白质上样量为110 μg，经固相pH梯度（IPG）（pH值4～7）胶条水合作用过夜后，再进行一维等电聚焦。而后将固化pH值梯度（IPG）胶条用平衡液Ⅰ[0.375 mol/L 三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2%十二烷基硫酸钠（SDS），10 mg/mL 二硫苏糖醇，痕量溴酚蓝]和平衡液Ⅱ[0.375 mol/L 三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2% SDS，0.1%二硫苏糖醇，25 mg/mL 碘乙酰胺，痕量溴酚蓝]分别平衡15 min后进行双向垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，采用考马斯亮蓝染色法检测[12]，而后用Image Scanner扫描仪（GE Healthcare，USA）对凝胶进行图像扫描，采用PDQuest 7.2软件（Bio-Rad，Hercules，USA）进行图像分析，包括蛋白点检测、背景扣除、人工校正和凝胶匹配等几个步骤，对感兴趣的蛋白点进行切胶、酶解、肽段浓缩、除盐、点板。将点板后的样品放入4 800 TOF/TOF串联飞行质谱仪（ABI，USA）检测。第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽片段序列信息一起通过GPS Explorer 3.6（ABI，USA）和Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白质数据库，找出匹配的蛋白。

1.2.2 iTRAQ 同样采用TCA-丙酮沉淀法提取石榴籽粒总蛋白，方法同“1.2.1”节。蛋白质定量后取试验样品 150 μg，还原，烷基化。胰酶处理，用iTRAQ试剂（ABI，USA）标记样品，用119、121 u胰酶标记后混合。用Shimadzu LC-20AB HPLC Pump分离，A流动相含25 mmol/L磷酸二氢钠、25%乙腈溶液，pH值2.7，B流动相含25 mmol/L磷酸二氢钠、含1 mol/L氯化钾的25%丙烯腈，pH值2.7。将分离后的肽段进一步用NanoAcquity（Waters，USA）进行反相分离，A有机相含2%乙腈和0.1%甲酸，B有机相含98%乙腈和0.1%甲酸，点板。利用Q-EXACTIVE（Thermo Fisher Scientific，USA）质谱仪对样品进行检测。本研究中石榴籽粒蛋白鉴定所使用的数据库为石榴转录组数据库。得到的肽片段序列信息通过Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白质数据库，找出匹配的蛋白。

2 结果与分析

2.1 三白石榴籽粒的2-DE分析

选用IPG胶条的pH值范围为4.0～7.0，marker分子量范围为14.4～116.2 ku，电泳图中分离的黑点为蛋白质。结果表明，三白石榴籽粒共检测到890个蛋白点。用PDQuest7.4软件对籽粒双向凝胶电泳图进行分析，发现在14.4～116.2 ku范围内，分子量主要集中在40～60 ku，大多數为中性蛋白；pH值主要集中在5.0～5.5，多为酸性蛋白。

2.2 基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF/TOF MS）质谱鉴定

根据双向电泳所得PfkB碳水化合物激酶家族蛋白的肽片段质量指纹图及其肽序列信息（图1），通过GPS-MASCOT的离子搜索模式检索NCBInr真核生物蛋白质数据库，检索种属为绿色植物，数据库检索的方式为combined，片段离子质量容差为±0.3 u，最大允许漏切位点为1，酶为胰蛋白酶；质量误差范围设置：PMF 100×10-6，串联质谱误差（MS/MS tolerance）为0.2 u。检索出后的蛋白质的分值及其所有肽段离子的总分值都在95%的可信区间内，即错误概率在 0.002 5 内，才确定此蛋白鉴定成功。

2.3 液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定的iTRAQ试验蛋白质

在数据库搜索中，MASCOT的离子搜索模式检索石榴转录组数据库。所有的胰蛋白酶特异性要求容差设定在可接受的范围内。半胱氨酸的烷基化设为固定修饰，肽段质量误差为0.02 u，其余参数同“2.2”节。通过iTRAQ分析可知，三白石榴籽粒中共检测鉴定出1 940种蛋白质，参与了53种代谢通路。在等电点3.0～12.0和分子量7.0～700 ku的范围内，其中分子量在10 ku以下的有16种蛋白，200 ku以上的有19种蛋白，pH值大于11的有11种蛋白。

2.4 iTRAQ试验二级质谱结果

在串联质谱中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114、116、118、120 u的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。图2为果糖激酶表达丰度的iTRAQ二级质谱结果。

3 讨论与结论

本试验分别利用2-DE、iTRAQ技术研究、比较了三白石榴籽粒的蛋白质差异表达变化。通过2-DE研究发现，三白石榴籽粒中共有890种蛋白，而用iTRAQ技术发现了1 940种蛋白，参与了53种代谢通路。可见iTRAQ技术发现总蛋白的种类、数量都比双向电泳技术要多。由于双向电泳和iTRAQ技术原理的差异，2-DE技术发现的蛋白大多是胞浆蛋白，而iTRAQ技术发现的不仅有胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白。因为在2-DE技术样品的制备中，要将组织或细胞中的蛋白释放出来并处于溶解状态，而疏水性蛋白和膜性蛋白是难以溶解的，因此容易丢失[13]。由于双向电泳技术本身的弊端，2-DE技术中首先要进行一维固相pH值梯度等电聚焦，强碱性的蛋白则需要克服反向、阴极向阳极移动以及电渗流等问题，难以分离和检测强碱性的蛋白。加上受高丰度蛋白的影响，低丰度蛋白的量少。因此，对于低丰度蛋白、极大（相对分子质量>200 ku）和极小蛋白（相对分子质量<10 ku）、极碱性蛋白和疏水性蛋白都难以进行有效分离，限制了其应用范围。而iTRAQ技术可以对任何类型的蛋白质进行鉴定[14]。在本试验中，利用iTRAQ技术检测到分子量在10 ku以下的有16种蛋白，200 ku以上的有19种蛋白，pH值大于11的有11种蛋白，而在双向电泳中未检测到这类蛋白。这可能是因为在三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸缓冲液中，样品和游离的十二烷基硫酸钠离子持续进行积累浓缩，与小分子量蛋白发生对流混合，产生的带较模糊，从而降低小分子量蛋白的分辨率，其次，可能由于质谱仪对小分子量蛋白较难鉴定。关于高分子量蛋白较少的原因，一方面由于高分子量蛋白渗进IPG胶条比较困难，另一方面是在变性条件下，蛋白质复合物被解聚成多肽或者是大分子，这都是二维电泳技术本身的一些局限性[15-16]，导致它对低丰度蛋白、偏碱蛋白，分子量偏大或偏小的蛋白等难以分离和检测，而此类蛋白对于基础与应用研究都极为重要（甚至比高含量结构蛋白更为重要）。此外，有时1个蛋白点含有不止1种蛋白，而在双向电泳中无法检测到，如PfkB碳水化合物家族蛋白在双向电泳中为1个蛋白，而在iTRAQ中检测到5个PfkB碳水化合物家族蛋白，说明双向电泳的灵敏度和重复性仍然不理想。而iTRAQ技术中的iTRAQ试剂为同位素，能与赖氨酸及所有肽链的氨基末端连接，即在理论上它能标记上所有的氨基酸。国内外多项研究表明，iTRAQ具有较好的定量效果和良好的重复性[1]，因此，用该技术检测的蛋白数量和种类要比2-DE技术的多。在本研究中，iTRAQ技术得到的蛋白数量是双向电泳的2倍的结果也证明了这一点，而且在双向电泳中鉴定到的蛋白在iTRAQ试验中也都能检测到。另外，由于2-DE操作费时费力，难以实现和质谱的直接联用，不易实现自动化。而iTRAQ技术可同时对8种或4种样本进行定量比较，省时省力。将非凝胶串联质谱技术与同位素标记技术相结合，能够实现对多种不同样本同时进行定量分析的目的。endprint

综上所述，iTRAQ在鉴定和比较总蛋白的数量、种类上比二维电泳技术有明显的优势。而且，iTRAQ技术可以通过信息检索了解到被检索肽段的真实身份，iTRAQ技术的出现，使得对同种蛋白质的变化鉴定更为准确。本研究对蛋白质组学中的二维电泳和iTRAQ 2种技术在石榴籽粒中的蛋白鉴定效果进行比较分析发现，iTRAQ技术得到的蛋白数量较多，种类丰富，可能更有利于进一步研究石榴籽粒中复杂的代谢通路，从而为籽粒形成的分子机制研究提供一定的理论参考。

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