SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）在汉族人群中的法医学调查

巩五虎，薛少华，张 岩，朱如心，赵珍敏

（1.西安市公安局刑事侦查局技术处，陕西 西安 710038；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）在汉族人群中的法医学调查

巩五虎1，薛少华1，张 岩1，朱如心2，赵珍敏2

（1.西安市公安局刑事侦查局技术处，陕西 西安 710038；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

目的评估SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）的性能及其所包含的STR基因座在汉族人群中的群体遗传学信息。方法应用试剂盒对1000名汉族健康无关个体进行分型检测，检测试剂盒有效性并统计分析STR基因座的频率数据及群体遗传学参数信息。结果该试剂盒最小扩增体系可以为6.25μL，标准体系25μL中DNA含量低至125pg可获取理想分型图谱。试剂盒中包含的21个常染色体STR基因座在1000人份中共检测到267个等位基因，均符合Hardy-Weinberg平衡。新增加的两个STR基因座D1S1656和D10S1248分别检测到15和11个等位基因，多态信息含量丰富。结论SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）对于血液样本检测性能优越，准确性、重复性、灵敏度均可满足法医学检案需求，可以应用于法医学实际检案及DNA建库工作。

法医遗传学；短串联重复序列；SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）；汉族

SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）由司法鉴定科学研究院研制。该试剂盒可一次检测22个STR基因座和一个性别鉴定位点Amelogenin（AMEL）。这些STR基因座既包含了目前国内外各个试剂盒生产商所采用的19个常染色体STR基因座[1-2]（vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX），又包括了2个在中国人群具有良好法医学应用价值的 STR 基因座[2-4]（D1S1656和D10S1248），还包括了一个用于排除因AMEL等位基因丢失造成性别误判的Y-STR基因座DYS391。本研究从试剂盒测试及采集基础数据的角度出发，对西安及上海两地的汉族无关个体进行测试，以期评判试剂盒效能并应用于实际检案工作。其中，试剂盒测试根据DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods，SWGDAM）对试剂盒有效性验证要求，从PCR扩增体系、重复性、准确性、灵敏度、特异性这些角度展开检测评估。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究共涉及1000份汉族健康志愿者的血样，采集于西安及上海两地，其中男性500份，女性500份。实验前对每名志愿者进行风险告知，并签署知情同意书。

用于特异性检测的动物样本为鸡、鸭、牛、羊、猪、狗、猫、兔和小鼠的血液样本；微生物样本为大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、黄色微球菌、绿脓杆菌、表皮葡萄球菌和唾液链球菌。

1.2 试剂与仪器

SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版，司法鉴定科学研究院）、Goldeneye®DNA身份鉴定系统 20A［基点认知技术（北京）有限公司］，9948标准品（美国Promega公司）、甲酰胺（美国Thermo Fisher Scientific公司）、自动化工作站（澳斯邦生物技术有限公司）、9700型PCR仪和3130xl基因分析仪（美国AB公司）。

1.3 PCR扩增和STR分型

采用自动化工作站进行血样DNA的提取。样本DNA采用标准检测体系25 μL进行扩增，其中包含2.5×反应缓冲液 10 μL，5×引物混合物 5 μL，0.5 μL DNA聚合酶，其余为去离子水和DNA样本。推荐DNA样本范围为0.5～2 ng，可以根据DNA样本浓度进行两者比例的调节。PCR扩增体系为：95℃ 5min；94℃ 30 min，60℃ 40 s，70℃ 50 s，30 个循环；60℃30min；4℃持续保温，直至取出样品。PCR产物变性后在3130xl基因分析仪上进行毛细管电泳，用Gene-Mapper®ID v3.2.1软件进行分型。

1.4 试剂盒有效性验证

1.4.1 PCR扩增体系测试

在实际检案工作中，当样本DNA量比较少或者进行DNA建库时，常采用缩小的PCR扩增体系进行检测。为测试小扩增体系的有效性，本研究分别采用25μL、12.5μL和6.25μL的体系对标准品9948进行扩增检测，检测重复3次。

1.4.2 重复性测试

从1000份志愿者中随机选择100份样本，分别在司法鉴定科学研究院法医物证学研究室和西安市公安局刑事侦查局技术处检测实验室进行分型检测，比对结果的一致性。

1.4.3 准确性测试

对上述100份样本采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统20A进行分型检测，比较相同的19个STR基因座基因型分型结果的一致性。

1.4.4 灵敏度测试

试剂盒的灵敏度检验主要用于判断该试剂盒可以产生可靠分型结果的DNA扩增范围，对于日常的检测工作具有重要的指导意义。本次分析中，主要是采用标准品9948进行梯度稀释，稀释的浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5 和 31.25pg。 重复检测 3 次。

1.4.5 特异性测试

法医物证检材受非人类DNA污染是日常检案工作中常见的一种现象。本研究对常见的一些非人类DNA采用该试剂盒进行分型检测是否会产生特异性PCR产物进行了评估。其中，常见的动物DNA种类包括鸡、鸭、牛、羊、猪、狗、猫、兔和小鼠；常见的微生物DNA主要为大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、黄色微球菌、绿脓杆菌、表皮葡萄球菌和唾液链球菌。上述样本均采用25μL体系中包含2ng DNA进行扩增检测，重复3次。

1.5 统计学分析

对试剂盒中涉及的21个常染色体STR基因座进行Hardy-Weinberg平衡检验和等位基因分布频率的计算；根据等位基因频率，采用PowerMarker v3.25进行基因变异度、杂合度和多态信息含量的计算。

试剂盒性能评估主要针对STR基因座，AMEL未纳入统计。平均基因座检出率的计算是样本成功检测基因座的平均值与试剂盒包含STR基因座（21个常染色体STR和DYS391）的比值，其中STR基因座发生丢峰或者均衡比低于60%认为检测失败[2，5]；平均等位基因峰高是样本检测等位基因的相对荧光单位（relative fluorescence units，RFU）与检测等位基因数目的比值。

2 结果与讨论

2.1 STR基因座的遗传信息

本研究结合国际法医遗传学会（International Society for Forensic Genetics，ISFG）对于 STR 命名的最新要求[6]，对试剂盒中涉及的21个常染色体根据人类基因组GRCh38和GRCh37序列分布进行了核心重复单元（motif）位置及结构的整理，结果见表1。其中，根据motif的结构信息可以分为简单、复合和复杂3种情况，仅基因座D21S11属于复杂情况，为[TCTA][TCTG][TCTA]TA[TCTA]TCA[TCTA]TCCATA[TCTA]，其中，TA、TCA、TCCATA碱基不纳入核心重复单元。除Penta E和Penta D基因座外，其余均为4碱基重复。对于这两个基因座上出现的OL等位基因，注意等位基因的命名。

表1 21个常染色体STR基因座的核心序列结构及位置信息

2.2 试剂盒有效性验证

对标准品9948分别采用25μL、12.5μL和6.25μL扩增体系进行PCR扩增和电泳检测，结果表明，采用三种不同扩增体系，样本均可以得到理想的扩增，且电泳分型结果准确可信。重复性检测主要选择100份样本分别在2个不同的实验室进行，分型结果一致。准确性检测主要是对上述100份样本分别采用2个不同的商业化试剂盒进行检测，其中19个相同的常染色体STR基因座分型结果一致。

采用标准体系进行灵敏度检测，结果表明，DNA模板量在125 pg到2 000 pg可以得到完整理想的分型图谱，平均峰高为596RFU到4231RFU。当DNA量降至62.5 pg和31.25 pg时，等位基因的平均检出率分别为95.45%和86.36%，等位基因的平均丢峰率增加，主要发生在大片段扩增产物峰；平均等位基因峰高呈现逐渐下降的趋势，当DNA量降至31.25 pg时，平均RFU为118（表2），可以满足分析要求。上述结果可以指导鉴定实践中采用该试剂盒进行复合扩增，获取理想分型结果对DNA量的要求。

对常见动物DNA和微生物DNA的检测结果均为阴性，表明该试剂盒具有高度特异性，可用于对人类DNA检材的检测及分析。

表2 SiFaTM23 Plex测试试剂盒（提取测试版）灵敏度测试结果 （n=3，±s）

表2 SiFaTM23 Plex测试试剂盒（提取测试版）灵敏度测试结果 （n=3，±s）

DNA模板量/pg等位基因峰高/RFU 2000 100.00±0.00 4231.03±552.25 1000 100.00±0.00 2431.50±545.89 500 100.00±0.00 1646.75±500.00 250 100.00±0.00 869.38±632.00 125 100.00±0.00 596.15±200.00 62.5 95.45±4.55 219.35±654.00 31.25 86.36±4.55 118.32±984.00等位基因平均检出率/%

2.3 基因座的法医学效能

本次检测中无关个体来源于西安及上海两地汉族人群。针对不同地区人群分别展开等位基因频率数据的计算，经显著性检验，发现数据分布差异无统计学意义（Pgt;0.05），合并人群统计21个常染色体STR基因座的等位基因分布及频率（表3）。在1000份无关个体样本中共检测到1 078个基因型、267个等位基因（表4）。采用PowerMarker v3.25统计发现，TPOX和TH01基因座的最大等位基因频率均大于0.5，导致这两个基因座基因变异度、杂合度和多态信息含量最小。在21个常染色体STR基因座中，本次检测发现Penta E基因座的基因变异度、杂合度和多态信息含量最高，均在0.9以上。新增加的两个STR基因座D1S1656和D10S1248分别检测到15和11个等位基因，遗传效能可满足法医学应用。另外，试剂盒中纳入的DYS391基因座主要针对性别进行进一步判断分析，同时对于父系关系鉴定提供一个STR基因座的基本信息。本研究中500名男性个体在该基因座上共检见 5 种等位基因 6、9、10、11、12，其中最为常见的等位基因为10和11。

表3 21个STR基因座的频率信息 （n=1000）

表 3（续）

表4 21个STR基因座的群体遗传学参数 （n=1000）

2.4 小结

本研究基于1 000份汉族无关个体样本探讨了SiFaTM23 Plex试剂盒（提取测试版）的法医学性能及STR基因座的多态信息。结果表明，试剂盒对于血液样本检测性能优越，25 μL标准体系中采用125 pg DNA可完全分型，等位基因分布均衡。采用成熟的PowerMarker软件可以获取常染色体STR基因座的基本遗传学参数，帮助法医学者快速判断相关STR基因座信息。

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2017-03-16）

（本文编辑：张素华）

Forensic Investigation in Han Population by SiFaTM23 Plex Kit （Beta Version）

GONG Wu-hu1,XUE Shao-hua1,ZHANG Yan1,ZHU Ru-xin2,ZHAO Zhen-min2
（1.Department of Technology,Department of Criminal Investigation,Xi′an Municipal Public Security Bureau,Xi′an 710038,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo investigate the performance of SiFaTM23 Plex Kit （beta version） and its population genetics of STR loci in Han population.MethodsGenotyping was performed for 1 000 unrelated healthy Han individuals by the kit.The efficiency of the kit was tested,and the frequency data and population genetics parameter information of STR loci were analysed statistically.ResultsThe minimum amplification system could be 6.25 μL.In 25μL standard reaction system,a satisfied genotyping profiles could be obtained with the DNA content as low as 125 pg.Among the 1 000 individuals,267 alleles were detected by 21 autosomal STR loci of the kit,which conformed to Hardy-Weinberg equilibrium.Fifteen and eleven alleles were observed at the newly added STR lociD1S1656andD10S1248,respectively,which showed a high polymorphism information content.ConclusionSiFaTM23 Plex Kit（beta version）is excellent in testing blood samples.Its accuracy,repeatability and sensitivity can satisfy the need of forensic practice,which makes it be applied to forensic-related case work and DNA database establishment.

forensic genetics;short tandem repeat;SiFaTM23 Plex Kit （beta version）;Han nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.015

1004-5619（2017）05-0516-06

上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ 2290900）；上海市标准研制项目（14DZ0502500）

巩五虎（1968—），男，副主任法医师，主要从事法医物证学研究工作；E-mail：gongwuhu1@126.com

赵珍敏，女，副主任法医师，主要从事法医物证学工作；E-mail：zhaozm@ssfjd.cn