杜仲叶部内生真菌的抗氧化活性测定以及菌株鉴定

刘 洋,张弘弛

(山西大同大学生命科学学院，山西 大同 037009)

杜仲叶部内生真菌的抗氧化活性测定以及菌株鉴定

刘 洋,张弘弛

(山西大同大学生命科学学院，山西 大同 037009)

本研究利用体外清除DPPH自由基的方法，测定了5株杜仲叶部内生真菌的抗氧化活性。通过插片培养，性状观察，显微摄影和分子鉴定对抗氧化活性高的杜仲内生真菌进行了分类研究。研究表明，这些杜仲内生真菌对DPPH清除率具有剂量依赖性，其抗氧化能力随样品浓度的增加呈增长趋势。在浓度为0.5 g/mL时，其中对DPPH自由基清除率在95 %以上的菌株有1株(EL05)，经鉴定属于曲霉属。

杜仲；内生真菌；抗氧化活性；显微摄影；ITS序列

杜仲Eucommia ulmoides 是杜仲科杜仲属植物，为我国特有的珍贵树种，其树皮经过干燥可入药，是名贵的滋补药材[1]。杜仲含有多种天然药物化学成分，包括木质素、苯丙素、黄酮、多糖、脂肪酸等[2]。研究表明内生真菌几乎存在于所有的植物体[3]，其受到植物组织的良好保护，与寄主植物协同进化，内生真菌可从宿主植物中吸收营养，也可通过自身的代谢产物或借助于信号转导作用对植物产生积极影响[4]。

本论文研究的目的是从杜仲内生真菌中寻找可以产生抗氧化活性物质的内生真菌，为天然抗氧化剂的来源提供另一生物资源，为缓解中药资源日益减少与药用植物资源需求量的不断增加之间的矛盾提供新思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DPH-600电热恒温培养箱，金坛市国旺实验仪器厂；SHZ-D(III)循环水式多用真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；JA5003B千分之一电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；Boxun超净工作台，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Mult I skan FC酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；LS-7SHD型立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱，上海晶坛仪器制造有限公司。

甲醇，无水乙醇，乙酸乙酯，DPPH(0.2 mmoloL-1，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-苦肼基)，1 %的水溶性苯胺蓝，苯酚，甘油，所有试剂均为分析纯。

1.2 材料和培养基

前期实验筛选出的5株源自杜仲叶部的产黄酮的内生真菌(EL01-EL05)，保存于山西大同大学应用生物技术研究所。

察氏(固体)培养基：NaNO31 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.25 g，MgSO40.25 g，FeSO40.005 g，葡萄糖15 g，(琼脂10 g)，蒸馏水1000 mL，121 ℃，灭菌25 min。

1.3 实验方法

1.3.1 内生真菌的发酵和产物提取

杜仲叶部内生真菌经平板活化后，接种于含100 mL察氏液体培养基的250 mL锥形瓶中(10瓶)，28 ℃，150 r·min-1振荡培养15 d，发酵滤液减压浓缩至100 mL以下，然后用乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得粗提物配置成1 g·mL-1的样品。

1.3.2 DPPH自由基清除率的测定[5]

96孔板稀释：取样品100 μL置于96孔板的各排的第一孔中，其余11孔中均加入90 μL甲醇，将第一孔中取10 μL加入第二孔中，依次将样品以10-1倍进行稀释，最后一孔取10 μL弃掉。然后在每孔中加入90 μL DPPH构成180 μL测定体系，测得的数据取平均值为(Ai)。

同样方法，96孔板每排的第一孔中加入各样品100 μL，然后在每排的其余各孔中均加入90 μL甲醇，从第一孔取10 μL样品加入第二孔，以10-1倍进行稀释，但不加DPPH，此为样品对照，记录数据为(Aj)。

取90 μL甲醇，90 μL的DPPH，作为空白对照测定吸光度。在96孔板的每块板上，取3个孔加入上述试剂，记录数据取均值为(Ac)。维生素C(Vc)为阳性对照。按公式：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，计算清除率。

1.3.3 显微摄影的实验方法[6]

插片培养：将4 ℃冰箱保藏的5株杜仲叶部内生真菌菌株用接种环挑取少量孢子(菌丝)，在平板培养基上以“Z字”划线接种，然后以无菌接种于平板中，并在平板中插入无菌盖玻片(以30°-40°角插入，深度约为盖玻片的1/3长度)。28℃，置于恒温培养箱培养。

性状观察：每隔一段时间(12h或者24h)观察。

制片检查：将盖玻片用镊子取出，滴一滴1%的水溶性苯胺蓝在合适的插片上静置15min，并以乳酚油为浮载剂。

1.3.4 分子鉴定[7]

活性内生真菌接种于察氏固体平板上，培养时间12 d，无菌低温(液氮)研磨菌丝和孢子至粉末，CTAB法提取真菌DNA，然后以基因组DNA为模板，PCR扩增该菌株DNA序列。PCR 扩增产物送三联兄弟生物医药研究(北京)有限公司测序，序列结果通过Blast比对分析，构建聚类分析图。

2 结果与讨论

3.1 杜仲叶部内生真菌对DPPH 的清除效果

抗氧化实验结果表明，杜仲叶部内生真菌的清除DPPH的能力随样品浓度的增加呈增长趋势(图1)。在样品质量浓度为0.5 ×10-4g·mL-1以下，各内生真菌的抗氧化活性差异性不明显；样品浓度在0.5×10-3g·mL-1至0.5 g·mL-1之间，EL04的抗氧化活性增长缓慢，其他菌种出现快速增长；在样品质量浓度为0.5 g·mL-1时，有2株菌株(EL03和EL05)表现出极高的清除DPPH自由基的能力，清除率在90%以上，表明这2株菌株在质量浓度为0.5 g·mL-1时，DPPH已大致上被清除掉了；对DPPH自由基清除率在80%～90%的菌株有1株(EL01)；清除率在70%～80%的有1株(EL02)；清除率小于70%的有1株(EL04)；其中(EL05)的清除效果最佳，高达95.2%，而(EL04)的清除效果最弱仅为68.5%。

图1 不同质量浓度下对DPPH自由基的清除率

Fig.1 DPPH free radical at different concentrations

3.2 高抗氧化活性杜仲内生真菌的菌落特征及菌种鉴定

图2 EL05菌落形态及菌丝(×10)和孢子形态(×40)Fig.2 The colonial morphology of the strain EL05

图3 菌株EL05菌落形态和系统发育分析Fig.3 The polymeric analysis of strain EL05

EL05的菌落特征：菌落菌落为乳白色，其上生有褐色隔膜，便于小颗粒孢子团附着，菌丝有爬壁现象，培养基质呈浅褐色。菌丝表面有有色物质、有隔膜，分生孢子梗直立，顶端膨大成球形，上生1-2层放射状分布的瓶状小梗，分生孢子梗较长，有隔膜，顶端有分枝，其上着生的串生分生孢子为球形(图2)。PCR 扩增后的ITS序列长604bp，聚类分析图(图3)分析该菌株与多株Aspergillus sp.聚合在一起，因而EL05与Aspergillus sp.具有同源性，结合形态学分析(菌落观测和显微观察)和ITS序列分析，EL05被鉴定为Aspergillus sp.。

3 结论

目前的抗氧化剂大多从植物中提取，从植物内生真菌中提取抗氧化剂并不多[8-9]。本文对5株杜仲叶部内生真菌的抗氧化活性进行了研究，发现其在体外表现出较佳的对DPPH自由基的清除能力。尤其是菌株EL05，清除率高达95.2%，这为我们以后的实验研究提供了理论依据。此外还发现杜仲叶部内生真菌的次级代谢产物对DPPH的清除率具有剂量依赖性。由于浓度的变化其清除DPPH的能力也会发生相应的改变，而且是递增的。此外，对活性菌株的鉴定结果表明，抗氧化能力在95%以上的菌株EL05属于曲霉属。

因此，通过此次对杜仲内生真菌抗氧化活性的研究，发现其在天然抗氧化剂开发方面具有一定的潜力，为天然抗氧化剂的来源提供新思路。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海:上海科学技术出版社,1986:2090．

[2] 管淑玉,苏薇薇.杜仲化学成分与药理研究进展[J].中药材,2003,26(2):124-129．

[3] 郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统,2001,20(1):148-152．

[4] Huang W Y, Cai Y Z, Xing J, et al. A potential antioxidant resource: endophytic fungus from medicinal plants [J]. Economic Botany, 2007, 61(1): 14-30.

[5] Kusari S, Lamshoft M, Zuhlke S, et al. An endophytic fungus from Hypericum perforatum that produces hypericin[J]. Journal of Natural Products, 2008, 71(2): 159-162.

[6] 刘 瑞,张弘弛,李 慧,等.一株恒山产蒙古黄芪内生真菌Penicillium griseofulvum次生代谢产物的分离和菌种鉴定[J].中国实验方剂学杂志,2016,22 (16):25-29.

[7] 张弘弛,刘 瑞,李 慧,等.恒山黄芪内生真菌Rhizopus sp.次生代谢产物的分离和鉴定[J]. 中国实验方剂学杂志,2017,23(4):68-72.

[8] 钱 龙,杨明飞,冉雪琴,等.银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定[J].山地农业生物报,2007,26(4):305-310.

[9] 朱欣婷,刘 云,李常春.粉背雷公藤内生真菌抗氧化活性的初步研究[J].中国民族民间医药,2012,21(18):46-47.

(本文文献格式：刘洋,张弘弛.杜仲叶部内生真菌的抗氧化活性测定以及菌株鉴定[J].山东化工，2017，46(20)：80-81，84.)

AntioxidantActivityofEndophyticFungithatProduceFlavonoidsfromEucommiaUlmoidesandIdentificationofStrains

LiuYang,ZhangHongchi

(College of Life Science, Shanxi Datong University, Datong 037009)

Using clearing DPPH free radicals in vitro, this experiment mainly determine antioxidant activity of 5 endophytic fungi from Eucommia ulmoides. The result showed that the endophytic fungi have a dose-dependent manner and their ability of clearing DPPH radicals has a growing trend with the increase of sample concentration. When the concentration is 0.5 g/mL, there are 1 strain which DPPH radical scavenging are more than 95 %. According to their morphology, cultural characteristics and ITS sequences, the strain EL05 was indentified as Aspergillus sp.

eucommia ulmoides;endophytic fungi;antioxidant activity;photographic photography;ITS sequences

2017-08-11

刘 洋(1995— )，在读大学生；通讯作者：张弘弛(1980—)，博士，副教授，主要从事应用微生物的研究。

Q939.9

A

1008-021X(2017)20-0080-02