沙棘油对小鼠变应性接触性皮炎的治疗作用

沈 琪，王 梅，康金森

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

沙棘油对小鼠变应性接触性皮炎的治疗作用

沈 琪，王 梅*，康金森

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

目的研究沙棘油对小鼠变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的治疗作用。方法60只ICR小鼠随机分为6组：空白对照组、模型对照组、高中低3个剂量沙棘油外用组(100%，50%和25%)及阳性药对照组(复方醋酸地塞米松乳膏)，每组10只。以2,4-二硝基氯苯(DNCB)致敏和激发建立小鼠ACD模型，耳部皮损情况评分作为模型建立成功与否的指标，在激发后48 h测定各试验组小鼠的耳廓肿胀度和脾指数，并以苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察小鼠耳部皮肤炎性细胞浸润等病理变化情况。结果小鼠耳肿胀度测定结果表明沙棘油高剂量组(9 mL/kg，外用)可明显抑制DNCB诱发的小鼠耳廓肿胀，与模型组比较差异有显著性(P< 0.01)，与阳性对照组比较差异无显著性(P> 0.05)，小鼠脾指数测定结果表明沙棘油各剂量组可能通过促进免疫器官发育来发挥一定的免疫调节作用。病理学检查结果表明，沙棘油各剂量组与模型组比较耳组织表皮增厚程度减小，表皮及真皮水肿明显减轻，淋巴细胞浸润明显减少，真皮血管扩张充血现象缓解，抑制炎性细胞浸润。结论沙棘油对DNCB诱发的小鼠ACD有明显的治疗作用，其作用机制有待进一步考察。

沙棘油；变应性接触性皮炎；免疫

沙棘系胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木，为药食两用植物。沙棘油是由沙棘的籽或果实中提取，可修复黏膜、皮肤损伤，临床上用于预防和治疗胃溃疡、皮肤烧烫伤等疾病。文献报道沙棘油对醋酸引起小鼠腹膜炎[1]和角叉菜胶所致大鼠足肿胀均有明显抑制作用[2]，抑制炎症递质释放，可降低毛细血管通透性。

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是T细胞介导的针对皮肤接触致敏原的免疫反应[3]，是最常见的皮肤病之一，具有难预防、发病机制复杂多样的特点。减少炎性细胞聚集、促进皮肤屏障功能恢复是目前治疗ACD的一个突破口。研究表明沙棘油对皮肤损伤具有一定的修复作用，但其对ACD是否有抑制作用少有报道，本实验通过建立2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱发的小鼠ACD模型，研究沙棘油对小鼠ACD的治疗作用。

1 材料和方法

1.1实验动物

雄性ICR小鼠，体重18～22 g，60只，来源于新疆医科大学实验动物中心 [SCXK (新) 2016-0013]；饲养于新疆医科大学实验动物中心屏障环境 [SYXK (新) 2016-0002]，SPF级动物房，饲养温度：恒温(21℃～23℃)，相对湿度：恒湿(45%～65%)，光照：12 h/12 h明暗交替，每笼5只饲养，自由进食和饮水；并在动物实验过程中按实验动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。

1.2主要试剂与仪器

2,4-二硝基氯苯(DNCB)(西亚试剂有限公司)，二甲苯、丙酮、吐温-80、甲醛溶液(天津市福晨化学试剂厂，分析纯)，沙棘油(新疆慧华沙棘生物科技有限公司，批号：20160302)，复方醋酸地塞米松乳膏(华润三九医药股份有限公司，批号：0503261)。

PQ202型飞利浦电动剃毛刀(珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司)，AB135-S型天平(瑞士梅特勒Mettler Toledo)，打孔器自制，DSX100型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.3实验方法

1.3.1 沙棘油各剂量组的制备

以吐温-80为溶剂，将沙棘油制备成100%、50%和25%(高、中、低)3个剂量的沙棘油给药组[2]。

1.3.2 小鼠ACD模型建立

按文献建立动物模型[4-7]，腹部脱毛(3 cm × 3 cm)后，用1% DNCB丙酮橄榄油溶液100 μL致敏，第2天再次涂100 μL强化致敏。第5天小鼠右耳内外侧耳面涂以1% DNCB丙酮橄榄油溶液20 μL进行激发。

1.3.3 实验分组与给药方案

实验动物随机分为6组，即空白对照组、模型对照组、阳性对照组、及沙棘油高、中、低剂量组(9 mL/kg、4.5 mL/kg、2.25 mL/kg)，每组10只。空白对照组给予等量吐温-80。按人与小鼠剂量换算公式，小鼠复方醋酸地塞米松乳膏用量为10 mL/kg。所有药物均于致敏前1 d开始腹部外用给药，每日1次，每次给药量180 μL，连续给药7 d。除模型组，其它各组于给药第2、3天进行致敏和强化致敏，给药第6天各组进行激发。

1.3.4 小鼠ACD模型评价指标

激发前、激发后48 h分别对小鼠耳部红斑、水肿、抓痕进行评分作为耳部皮损情况评价指标，评分标准见表1；耳部皮损情况评分为建模成功与否及过敏反应程度的评价指标。

1.3.5 小鼠耳廓肿胀度及脾指数测定

激发后48 h脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用7 mm打孔器分别在两耳同一部位打下耳片，称重，以两耳片的重量差异为肿胀度。耳廓肿胀抑制率计算如下：抑制率(%)=(模型对照组肿胀度-实验组肿胀度)/模型对照组肿胀度× 100%。同时取小鼠脾脏称重，以每10 g体重的脾质量作为脾指数。

表1 小鼠耳部皮损情况评分标准

1.3.6 小鼠耳廓组织病理学检查

激发后48 h，每组分别取5只小鼠，取右耳皮肤组织标本经石蜡包埋固定，制成5 μm薄层切片，以苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)进行染色，并使用光学显微镜观察皮肤组织的病理变化，主要包括真皮水肿程度、炎症细胞浸润及其数目变化等情况。

1.4统计学方法

2 结果

2.1小鼠ACD模型评价指标

结果见表2。小鼠经耳部给予1% DNCB，激发30 min后，可见耳部激发处皮肤开始红肿，小鼠搔抓现象明显，48 h后小鼠耳部红肿且均有挠抓痂皮，部分小鼠耳部水肿化脓。与空白对照组相比，ACD建模小鼠耳部皮损情况评分均明显增加(P< 0.01)，提示小鼠ACD模型成功建立。

2.2各组药物对ACD模型小鼠耳肿胀度的影响

结果见表3。由表可见，沙棘油给药组和阳性对照组均能抑制小鼠耳肿胀度的增加，其中沙棘油高剂量组(9 mL/kg，外用)可明显抑制DNCB诱发的小鼠耳廓肿胀，与模型组比较差异有显著性(P< 0.01)，与阳性对照组比较差异无显著性(P> 0.05)，抑制效果与阳性对照组接近。

Tab.2Scoring of the ear skin injury in the mice in each group

组别Groups剂量/mL/kgDose耳变态评分Scoresofearabnormalities致敏前Beforesensitization激发后48h48hafterstimulation空白对照组Blankcontrolgroup00.0±0.0模型对照组Modelcontrolgroup05.2±0.8**阳性对照组Positivecontrolgroup1005.2±0.8**沙棘油高剂量组High-doseseabuckthornoilgroup905.2±0.4**沙棘油中剂量组Medium-doseseabuckthornoilgroup4.505.3±0.7**沙棘油低剂量组Low-doseseabuckthornoilgroup2.2506.6±0.8**

注：与模型对照组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

Tab.3Comparison of the degree and inhibitory rate of mouse ear swelling in each group

组别Groups剂量/mL/kgDose耳肿胀度/mgEarswellingdegrees抑制率/%Inhibitoryrate空白对照组Blankcontrolgroup0.65±0.16**模型对照组Modelcontrolgroup12.22±2.30阳性对照组Positivecontrolgroup105.34±3.03**59.53沙棘油高剂量组High-doseseabuckthornoilgroup95.80±2.30**54.47沙棘油中剂量组Medium-doseseabuckthornoilgroup4.510.44±0.6523.62沙棘油低剂量组Low-doseseabuckthornoilgroup2.2510.30±5.7021.72

注：与模型对照组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3小鼠ACD模型耳廓皮肤组织病理变化

2.3.1 建模后小鼠耳廓皮肤组织病理变化

正常小鼠耳部组织学结构清楚，层次分明，表皮厚度正常，细胞内及细胞间无水肿，无明显炎性细胞浸润，见图1A。ACD模型组小鼠耳表皮增厚，创面有部分缺失，可见轻度细胞内水肿及中度细胞间水肿，真皮浅层大量炎症细胞浸润，真皮血管扩张充血明显，与典型接触性皮炎病理相符，见图1B。

2.3.2 药物处理后小鼠耳廓皮肤组织病理变化

ACD模型组小鼠经不同剂量沙棘油及复方醋酸地塞米松乳膏腹部外用处理后，耳部组织表皮增厚程度减小，表皮及真皮水肿减轻，炎症细胞浸润明显减少，真皮血管扩张充血现象缓解，见图1C～1F。在细胞间水肿减少程度上，阳性对照组更为明显；在炎性细胞浸润渗出减少程度上，沙棘油高剂量的抑制效果与阳性对照组接近，且沙棘油给药组可见肉芽组织。以上表明沙棘油及复方醋酸地塞米松乳膏均能改善小鼠ACD模型耳部炎症浸润，在抑制血管扩张充血效果上沙棘油高剂量组更为明显。

2.4各组药物对ACD模型小鼠脾指数影响

结果见表4。由表可见阳性对照组小鼠的脾指数低于空白对照组，而沙棘油各剂量组小鼠脾指数均高于空白对照组。复方醋酸地塞米松乳膏为糖皮质激素类药物，有免疫抑制作用，用药后小鼠脾指数降低。沙棘油各组可能通过增强机体的细胞免疫、促进免疫器官发育、恢复异常体液免疫功能，使免疫系统趋于平衡来发挥作用。

Tab.4Comparison of spleen indexes of the mice in each group

组别Groups剂量/mL/kgDose脾指数/10mg/gSpleenindex空白对照组Blankcontrolgroup51.52±13.26模型对照组Modelcontrolgroup60.07±15.64阳性对照组组Positivecontrolgroup1035.13±8.13*沙棘油高剂量组High-doseseabuckthornoilgroup973.18±18.78**沙棘油中剂量组Medium-doseseabuckthornoilgroup4.569.71±9.96**沙棘油低剂量组Low-doseseabuckthornoilgroup2.2564.50±6.10*

注：与空白对照组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：阳性对照组；D：沙棘油高剂量组；E：沙棘油中剂量组；F：沙棘油低剂量组。图1 各组小鼠耳廓皮肤组织病理变化的比较(× 20)Note. A: Blank control group; B: Model control group; C: Positive control group; D: Group of high-dose sea buckthorn oil; E: Group of medium-dose sea buckthorn oil; F: Group of low-dose sea buckthorn oil.Fig.1 Comparison of pathological changes in the ear skin of each group

3 讨论

ACD是最常见的皮肤病之一，具有难预防、发病机制复杂多样的特点，目前治疗ACD的常用药中，抗组胺药对炎症介质有拮抗作用，对I型超敏反应有效，但不能抑制IV型超敏反应病变部位的炎细胞浸润；糖皮质激素类虽然显效快、作用强、疗效确切，但不适合长期临床应用。因此，寻找能安全、有效抑制IV型超敏反应的药物是目前的一个研究重点。小鼠ACD模型是免疫学上研究IV型变态反应的经典模型[5]，且不同诱导物产生的动物模型与药物作用靶位有相关性。目前多数学者认为，DNCB诱发Th1细胞介导的变态反应[8]，且DNCB与细胞的蛋白质载体结合刺激细胞因子释放；异硫氰酸荧光素(FITC)诱发Th2细胞介导的变态反应，FITC与血清中的蛋白质载体结合刺激细胞因子释放[9]，本实验采用DNCB作为小鼠ACD模型诱导物，研究沙棘油对小鼠ACD的治疗作用。

因为脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，故本实验对小鼠脾指数进行测定。实验结果表明沙棘油各剂量组小鼠脾指数均高于空白对照组，而复方醋酸地塞米松乳膏给药组低于空白对照组，提示复方醋酸地塞米松乳膏等糖皮质激素类药物是通过抑制机体的多个免疫环节，从而发挥治疗ACD的作用，但长期使用此类药物会诱发感染或加重感染，可使体内潜在的感染灶扩散或静止感染灶复燃，特别是原有抵抗力下降者。沙棘油各剂量组小鼠脾指数升高，推测沙棘油是通过增强细胞免疫功能，恢复异常体液免疫功能，使免疫系统趋于平衡来发挥作用，这对具有复发特点的ACD治疗有长期应用优势。

另外，根据小鼠耳肿胀度和耳廓皮肤组织病理切片结果发现沙棘油和复方醋酸地塞米松乳膏均具有良好的抗炎症作用，可以抑制炎性介质释放，降低毛细管通透性。研究报道表明沙棘油具有减少炎症物质产生、调节免疫、促进小鼠巨噬细胞的吞噬功能、恢复免疫抑制状态下的天然杀伤细胞(natural killer cells，NK)水平的作用[10-11]，因此推断沙棘油是通过控制炎性因子和免疫性因子而发挥治疗ACD的作用[5]。沙棘油各组小鼠耳廓皮肤组织病理切片镜下可见肉芽组织，而阳性对照组中未观察到。因复方醋酸地塞米松乳膏等糖皮质激素类药物，有抑制肉芽组织增生作用，防止炎症后期粘连和瘢痕形成，但这也将降低机体的防御和修复功能，可导致感染的扩散和延缓创口的愈合。与复方醋酸地塞米松乳膏比，尽管沙棘油不能防止炎症后期粘连和瘢痕形成，但可以促进创伤的愈合和修复[12-13]。

本文对沙棘油治疗ACD药效进行了初步研究，结果表明沙棘油在治疗ACD方面疗效明显，且无糖皮质激素类药物副作用，提示沙棘油在治疗ACD中具有明显的优势。目前沙棘油治疗ACD作用机制尚不明确，有待进一步考察。

[1] 车锡平, 霍海如. 沙棘果油对小白鼠的镇痛作用及对大鼠实验性胃溃疡的影响 [J]. 沙棘, 2001, 14(1): 34-37.

[2] 车锡平, 霍海如, 封卫毅, 等. 沙棘油栓局部用药对小白鼠等的抗炎作用和毒性实验 [J]. 沙棘, 1995, 8(3): 40-44.

[3] 李林峰. 接触性皮炎与皮肤变态反应 [M]. 北京: 北京大学医学出版社, 2003.

[4] 陈奇. 中药药理研究方法学 [M]. 第3版. 北京: 人民卫生出版社, 2011.

[5] 许宗严, 吴铁, 吴志华. 鼠皮炎湿疹模型建立的研究进展 [J]. 中国临床药理学与治疗学, 2005, 10(7): 730-733.

[6] 李圆圆, 阎春林, 马莉, 等. 变应性接触性皮炎小鼠模型评价指标探讨 [J]. 中国实验动物学报, 2008, 16(5): 353-356, 404.

[7] 孙明立, 魏敏杰, 金万宝, 等. 两种变应性接触性皮炎动物模型的建立及比较 [J]. 中国实验动物学报, 2008, 16(2): 132-134, 68.

[8] Tang A, Judge TA, Nickoloff BJ, et al. Suppression of murine allergic contact dermatitis by CTLA4Ig. Tolerance induction of Th2 responses requires additional blockade of CD40-ligand. [J]. J Immunol, 1996, 157(1): 117-125.

[9] Hopkins JE, Naisbitt DJ, Kitteringham NR, et al. Selective haptenation of cellular or extracellular protein by chemical allergens: association with cytokine polarization [J]. Chem Res Toxicol, 2005, 18(2): 375-381.

[10] 车锡平, 徐威, 霍海如, 等. 沙棘果油的抗炎作用和对免疫功能影响的实验研究 [J]. 沙棘, 2000, 13(4): 28-32.

[11] 任力飒. 沙棘籽油抗突变抗免疫抑制作用的观察 [J]. 沙棘, 1992, 5(4): 23-26.

[12] 周卫东, 王玲, 邹凤, 等. 耳内镜下沙棘油棉片贴补治疗外伤性鼓膜穿孔 [J]. 听力学及言语疾病杂志, 2011, 19(3): 273-274.

[13] 王志远, 罗小林, 何彩萍. 沙棘油治疗烧伤创面的临床观察 [J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(1): 124-125.

Therapeuticeffectofseabuckthornoilonallergiccontactdermatitisinmice

SHEN Qi， WANG Mei*， KANG Jin-sen

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect of sea buckthorn oil on allergic contact dermatitis (ACD) in mice.MethodsA total of 60 ICR mice were randomly divided into 6 groups: blank control group, model control group, three groups of high-dose, medium-dose and low-dose sea buckthorn oil (100%, 50%, 25%,adus.ext.), respectively, and positive control group (compound dexamethasone acetate cream), with 10 mice in each group. The mouse model of ACD was established by sensitization and stimulation with 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB), and injuries in the ear skin of the mice were scored and used as the indicator of successful establishment of the model. The degree of ear swelling and the spleen index of the mice in each group were measured at 48 h after stimulation. Hematoxylin and eosin staining was used to observe the pathological changes in the mouse ear skin.ResultsMeasurement of the degrees of ear swelling showed that the high-dose sea buckthorn oil group (9 mL/kg,adus.ext.) obviously inhibited the DNCB-induced ear swelling in the mice, with a significant difference compared with the model group (P< 0.01) and non-significant difference compared with the positive control group (P> 0.05). The result of the spleen index assessment showed that sea buckthorn oil at each dose may play an immune-regulatory role by promoting the development of immune organs. The pathological examination showed that epidermis thickening of the ear tissue, epidermal and dermal edema and infiltration of lymphocytes were reduced, dermal vasodilatation and congestion were alleviated, and inflammatory cell infiltration was inhibited in the three groups of different doses of sea buckthorn oil compared with the model control group.ConclusionsSea buckthorn oil has an obvious inhibitory effect on the DNCB-induced allergic contact dermatitis in mice. However, its related mechanisms remain to be further investigated.

Sea buckthorn oil; Allergic contact dermatitis, ACD; Immunity

沙棘油纳米乳的制备研究(编号：CXCY096)。

沈琪(1992 -)，女，硕士研究生，专业：药物新剂型。E-mail: 2529110682@qq.com

王梅(1978 -)，女，副教授，研究方向：药物新剂型和药物传输系统。E-mail: wm630@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0050-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.010

2017-03-19