光学显微系统的图像质量优化方法

崔长彩， 张勇贞， 易定容， 孔令华， 刘志群

(1. 华侨大学 制造工程研究院， 福建 厦门 361021；2. 华侨大学 机电及自动化学院， 福建 厦门 361021；3. 福建工程学院 机械与汽车工程学院， 福建 福州 350118)

光学显微系统的图像质量优化方法

崔长彩1， 张勇贞1， 易定容2， 孔令华3， 刘志群2

(1. 华侨大学 制造工程研究院， 福建 厦门 361021；2. 华侨大学 机电及自动化学院， 福建 厦门 361021；3. 福建工程学院 机械与汽车工程学院， 福建 福州 350118)

为了改善显微成像系统的照明均匀度和光照度，对透射式显微镜照明装置中的聚光镜进行优化设计.首先，分析由双透镜组成的阿贝聚光镜光轴不对中、通光孔径小等问题对成像质量带来的负面影响.然后，提出用单一非球面透镜替代双透镜聚光镜来改善成像质量的方法.最后，实测聚光镜改进前后的照明装置对显微镜照明均匀度和光照度等关键性能指标的影响.实验结果表明：在20X，40X物镜下，使用单个非球面透镜组成的聚光镜的照明装置的照明均匀度分别达到0.50%和0.66%，比改进前的双透镜聚光镜的均匀度提高5倍；同时，优化聚光镜后的照明装置光照度比优化前分别提高了15%和17%.实际样本实验也表明，使用单个非球面镜聚光镜的照明装置能有效提高照明均匀度和光照度，可以改善透射式光学显微镜的成像质量.

照明均匀度； 光照度； 非球面透镜； 阿贝聚光镜； 光学显微成像方法

随着全自动数字扫描显微成像技术的发展，光学显微成像技术在病理诊断上的应用越来越广泛.病理诊断和生物检测的成像过程中对图像质量要求越来越高[1-2]，图像的好坏直接影响光学显微系统的评定、自动对焦精度等问题[3].照明装置是光学显微成像系统的重要组成部分，其照明均匀度和光照度是影响显微成像系统图像质量的两个重要因素.光学显微系统的性能直接受照明均匀度和光照度的影响，文献提出分别采用软件和硬件的方法来提升照明均匀度和光照度的性能.李庆忠等[4]运用小波变换算法增强图像照度；梁琳等[5]阐述了图像增强算法对不同领域的图像均匀性提升；朱珂汉等[6]采用掩膜法对透射显微镜的照明均匀度进行了有效校正.软件算法虽在一定程度上提高图像质量，但往往容易受背景与样本的对比度影响，改善效果并不明显.硬件优化则是在成像前对照明光路做了改进.朱晓萌等[7]在基于卤素灯光源的基础上研制了一套FF-OCT成像系统，使用改进型科勒照明装置在提升图像质量方面取得了不错的效果；Deng等[8]早期将近百个复眼透镜阵列植入聚光装置内，显著地改善了成像均匀性；王沛沛等[9]利用双排复眼透镜实现大面积均匀照明.由于复眼透镜太小加工难度大、成本高且工作环境要求严格，较少在普通生物显微镜上应用.本文采用只包含单个非球面透镜的聚光镜来同时提升照明均匀度和光照度，实验结果证明该方法可行.

1 显微镜照明装置的原理与优化分析

1.1显微镜的照明装置

图1 科勒照明原理Fig.1 Principle of Kohler illumination system

常用显微镜的照明装置有临界照明和科勒照明.临界照明实际上就是把光源(比如灯丝)直接成像到被照物体上的一种照明方法.这种照明方法容易实现且光能利用率高，相当于在物平面上放置光源，但容易受光源表面亮度不均匀或细小的结构影响.观测生物标本一般采用比临界照明装置具有更高均匀度的科勒照明.常规科勒照明的原理，如图1所示.由图1可知：灯丝产生的卤素光源经集光镜在光阑2成像，再由聚光镜将光阑2得到的光在物镜的入口成像(一般为无穷远处)；同时，聚光镜还将光阑1进入的光成像于标本面上；光阑1，2可以分别调整光源的入光孔径和视场成像光阑，分别称为孔径光阑和视场光阑.因此，科勒照明能够获得均匀的照明效果.

在科勒照明中，聚光镜在孔径光阑和视场光阑的成像时都扮演重要的作用，可以保证系统的照明均匀度.因此，对聚光镜具有非常高的要求.聚光镜通常是由多个透镜组成，多透镜轴向是否对中是影响聚光镜性能的主要因素.透射光照明成像系统结构简图，如图2所示.通过改进多透镜组是提高照明装置的光照度和均匀性的方法之一.

图2 透射光照明成像系统结构简图Fig.2 Framework of illumination imaging system

1.2显微成像系统的照明均匀度和光照度

采用均匀度和光照度指标分析显微成像质量.由光照度的定义[10-11]可知，光照度(E)、光强值(I)、光源与受照面积之间的距离(R)、光源通过照明装置的孔径角(γ)之间的关系为

由此可知：光照度和点光源的光强成正比，与光照距离平方成反比，与孔径角γ的余弦值成正比.当γ=0(即垂直照明)时，光照度达到最大.

由光照度可得照明均匀度的定义[12]为

1) 光照度的度量.光照度的度量采用平均灰度值的比率(η)度量，计算式为

2) 均匀度的度量.均匀度表示图像每个像素点与整体均值的偏离程度，可用变异系数cV表示，即

表1 聚光镜的类型Tab.1 Type of condensers

点处的灰度值；M,N分别代表图像的行、列数.

2 聚光镜的原理与优化分析

2.1阿贝聚光镜的工作原理

聚光镜的分类根据畸变修正程度和使用的领域如明场、暗场、相位相反等不同而有所不同. 按畸变修正程度分类是一种较为常用的分类方法，如表1所示.

图3 阿贝聚光镜光路图Fig.3 Abbe condenser optical pathway

文中的生物显微镜采用的是没有对球差和色差进行畸变修正的双透镜阿贝聚光镜.它由若干个光学透镜组按轴线方向的位置关系排列组成，如图3所示.其工作原理：从点光源发出的发散光聚集成平行光束进入聚光镜的孔径光阑，根据对应物镜的数值孔径值调整孔径光阑保证入射的平行光以一定半径的光通量进入聚光镜的透镜组中；然后，经过多次折射以光锥的形式汇聚到样本面上；最后，由样本面上的光以最佳的孔径角α入射到物镜，最终在相机成像的过程.

光线经过孔径光阑进入阿贝聚光镜的双透镜组，经过多次折射进入到物镜的入瞳孔内.在多次折射过程中，对双透镜组的轴线对中要求是非常严格的.然而，实际工厂的组装环境不具备光轴对中检验设备，难以保证透镜组光轴的一致性.另外，光源也是影响照明均匀性的因素之一.理想点光源不具有方向性，是实现理想均匀照明的条件之一，但实际光源并非理想点光源，均匀照明时难免会受到具有方向性光源的影响.

为了尽可能地减少影响，可以通过选择数值孔径大的物镜来利用系统的光通量，但光通量的增大会加剧亮度的方向选择性.因此，由修正的不同视场β(光线范围与光轴中心的夹角)处的照度公式可知

式(5)中：Bi为某一角度βi对应亮度值；B0为沿光轴方向的亮度值，B0值大于等于Bi；E0为沿光轴方向的照度值；Ei为某一角度βi对应的照度值，同样地，E0值大于等于Ei.不同的βi会引起不同的光照度值变化，由此可知，光源亮度的方向性会造成视场的不均匀照明.

另外，阿贝聚光镜的通光孔径不能太大，否则,球差变大会导致照明均匀度变差，从而限制了光通量，影响了光照度的大小.因此，通过调整孔径大小无法同时提高均匀度和光照度.在物镜数值孔径值高于0.60时，阿贝聚光镜色差、球差容易显现出来.因此，阿贝聚光镜多用于普通显微镜上，不满足具有高倍数且高数值孔径的高端光学显微成像系统的要求.

2.2非球面单透镜聚光镜的设计

图4 非球面单透镜聚光镜仿真设计Fig.4 Single lens of aspherical condenser

阿贝聚光镜透镜组的光轴不对中和光源等因素会影响照明装置的均匀度和光照度，且标本照明难以同时获得高的均匀度和光通量.采用单透镜聚光镜解决光轴不对中问题，而为同时提高光通量和均匀度，采用非球面设计，即采用由单个非球面透镜组成的聚光镜设计方案.虽然非球面透镜的加工复杂，但现代精准微纳加工技术可以实现非球面光学透镜加工.图 4为非球面单透镜聚光镜设计，通过仿真设计得到最佳面型尺寸.图4中：W为聚光镜的通光孔径，取值为49 mm；h为透镜的最大厚度，取值为21 mm；非球面透镜的1，2面半径大小分别为30，60 mm的球面，球心均在X坐标轴上.

3 实验结果与分析

3.1聚光镜轴向高度的选取

图5 聚光镜的不同轴向高度成像实验Fig.5 Experiments of condenser imaging under different axial height

由图5可知：位置1到位置16的曲线反映随着聚光镜逐渐靠近样本，图像的灰度值越大.由此可知，聚光镜的轴向高度对成像质量的影响是不可忽视的.因此，在对比实验和测试样过程中，可将聚光镜调整为统一的轴向高度.

3.2透明样本的对比实验

分别选取20X和40X物镜对样品的照明均匀度和光照度进行测试，实验条件,如表2所示.为了减少相机的曝光时间对成像亮度值的影响，以及保证对比实验条件一致，满足成像要求，在20X/NA=0.65物镜下，选取曝光时间为5 ms，而在40X/NA=0.75物镜下，选取曝光时间为4 ms.无样本载玻片更有利于评价照明均匀度和光照度，因此,选用透明载玻片作为观测样本.为了达到聚光的最佳效果，调整聚光镜NA值和相应放大倍数物镜的NA值相同.

由表2可知:在20X/NA=0.65的物镜下，测试得到采用由单个非球面透镜组成的新聚光镜的比率η为1.15，相比于使用双球面透镜的旧聚光镜提高了15%的照度值;而在40X/NA=0.75的物镜下，测试得到新聚光镜的比率η为1.17，相比于旧聚光镜提高了17%的照度值.

表2 透明样本对比实验条件Tab.2 Transient sample comparison experimental conditions

为了比较新旧聚光镜的光照度，令旧聚光镜的光照度比率(η)为1.00，新旧聚光镜的性能对比，如表3所示.显微镜相机采集到的透明样本图片按分块方式处理，即求取每一列像素的平均灰度值，绘制曲线如图6所示.由图6可知：旧聚光镜评价曲线中心区域的灰度值大于两侧，即照明光场分布呈现余弦分布，图像边缘的光强约为中心光强的97%.优化后，由于光通量的增加，有效地减少了余弦分布的趋势，即新聚光镜的评价曲线趋势基本趋于水平.

表3 新旧聚光镜的性能对比Tab.3 Comparison of performance between old and new condenser

(a) 20X物镜 (b) 40X物镜图6 不同倍数物镜下透明样本图像处理结果Fig.6 Image processing results of transparent samples under different multiplier

测试数据表明：文中所设计的非球面单透镜聚光镜在20X，40X物镜的条件下均实现了光照度的提升；不同放大倍数的数据偏差主要是在不同条件下相机曝光时间参数设置不同引起的.

3.3照明均匀度的对比实验

分别在20X，40X物镜条件下对透明载玻片样本采集图像，并计算不同条件下新旧聚光镜获得的图像的cV值.在20X/NA=0.65的物镜下，测试得到旧聚光镜的cV值为2.22%，而采用由一个非球面单透镜组成的聚光镜获取的图像cV值可达到0.50%.在40X/NA=0.75的物镜下，测试得到旧聚光镜的cV值为2.86%，而采用非球面单透镜的新聚光镜获取的图像cV值可达到0.66%.cV值越小表示图像均匀度越好，表明系统的照明均匀度越高.综上，与传统的双透镜聚光镜相比，非球面单透镜聚光镜对照明装置的均匀度有较明显的改善.

表4 实物样本成像条件Tab.4 Physical sample imaging experiment conditions

3.4实物样本图像质量对比实验

在同样条件下对实物样本做成像实验，采用Motic BA410E显微镜和Motic Pro285A相机,以染色细胞样本1和标准线对板样本2 (ready optics extreme group 11)作为观察对象,实验条件如表4所示.

采集的样本优化前后聚光镜在Motic 20X和40X物镜下的对比结果,分别如图7，8所示.由图7，8可知： 由于照明均匀度受样本干扰严重， 无法对测试实验均匀度做评价.

(a) 传统双透镜阿贝 (b) 单个非球面透镜 (c) 传统双透镜阿贝 (d) 单个非球面透镜 聚光镜下染色细胞图 聚光镜下染色细胞图 聚光镜下标准线对板图 聚光镜下标准线对板图图7 20X物镜下新旧聚光镜对比实验Fig.7 Comparison between two condensers under 20X objective

(a) 传统双透镜阿贝 (b) 优化后单个非球面 (c) 传统双透镜阿贝 (d) 优化后单个非球面透镜聚光镜下染色细胞图 透镜聚光镜下染色细胞图 聚光镜下标准线对板图 聚光镜下标准线对板图图8 40X物镜下聚光镜优化前后对比测试实验Fig.8 Comparison between two condensers under 40X objective

实物测试的光照度计算方法和对比实验的方法一致，处理数据结果如表5所示.由表5可知：同一样本在不同放大倍数下成像对照明光照度的影响略有不同，相比于40X物镜的视场，20X物镜的视场范围更大，反映更多样本信息，优化前后的灰度值相差较大.从透明样本对比结果(表3)显示，在20X和40X物镜的成像系统及相同的摄像条件下，优化后平均灰度值分别提升了28.5和26.9，而染色细胞测试的灰度差值均小于透明样本对比的实验结果.这是由于染色细胞的透光性较差，优化前后的差值在一定程度上有所减少，均小于对比实验的结果差值.由表5还可知：20X物镜下单个非球面透镜聚光镜的染色细胞和分辨率板的比率分别为1.15，1.15；40X物镜下单个非球面透镜聚光镜的染色细胞和分辨率板的比率分别为1.18，1.17.综合不同生物样本的测试情况，20X和40X物镜下新聚光装置对光照度分别提升了15%和17%.

表5 实物光照度计算与实验方法对比Tab.5 Comparison of physical illumination calculation and experimental method

4 结论

根据高端生物显微镜成像质量要求高的特点，提出使用单个非球面透镜的聚光镜代替传统双透镜阿贝聚光镜的方法，用于改善数字显微成像系统的照明均匀度和光照度.实验结果证明，在生物显微镜常用的20X和40X物镜观察下，新聚光镜在照明均匀度方面的提升将近5倍(即cV值降低大约5倍).优化后的聚光装置在20X物镜下光照度的提升约为15%，40X物镜下光照度的提升约为17%.

在不同实际观察样本下，相比传统双透镜阿贝聚光镜下观察效果，单个非球面透镜的聚光装置能有效地改善显微成像系统数字照明均匀度和光照度，为成像系统提供高质量图像.与已有双排复眼透镜均匀照明装置相比，两者都能提高照明均匀度.但是，文中方法的优势在于造价相对较低，不存在双排复眼透镜对准问题，因而具有更高的性价比，更适合先进生物医学光学显微镜.

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(责任编辑： 陈志贤英文审校： 崔长彩)

ImageQualityOptimizationMethodofOpticalMicroscopySystem

CUI Changcai1， ZHANG Yongzhen1， YI Dingrong2， KONG Linghua3， LIU Zhiqun2

(1. Institute of Manufacturing Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， China；2. College of Mechanical Engineering and Automation， Huaqiao University， Xiamen 361021， China；3. College of Mechanical and Automotive Engineering， Fujian University of Technology， Fuzhou 350118， China)

The condenser of a transmissive optical microscope was optimized for improving its illumination uniformity and intensity. First， the adverse impact on the image quality resulting from potential misalignment of optical axes and small aperture of a multi-lens Abbe condenser was discussed. Then， an optimized design was proposed by using a single aspheric lens to replace the multi-lens Abbe condenser to improve the uniformity and intensity of illumination system. Finally， experiments were conducted to investigate the effects of the single aspheric lens condenser on image quality. The experimental results showed that the illumination uniformity of the microscope with the optimized condenser reached 0.50% and 0.66% under objectives with 20X and 40X magnifications respectively which were about 5 times better than those of the two-spherical lens condenser. Meanwhile， the intensity of the microscope with the new condenser increased over 15% and 17% under 20X and 40X objective lenses respectively as compared to those of the two-lensed system. Therefore， the optimized illumination system with a single aspheric lens can effectively improve the image uniformity and the intensity of the microscope， which results in an image of better quality.

illumination uniformity； illumination intensity； aspheric lens； abbe condenser； optical microscope imaging method

10.11830/ISSN.1000-5013.201703056

TP 394.1； TH 691.9

A

1000-5013(2017)06-0768-06

2017-03-24

崔长彩(1972-)，女，教授，博士，主要从事表面形貌评定技术、表面形貌测量技术及自动测量仪器的研究.E-mail:cuichc@hqu.edu.cn.

国家自然科学基金资助项目(51235004， 51475176)