Parkin基因表达对过氧化氢致线粒体损伤的保护作用

常春艳 平锋锋 洪善超 王晓明

(无锡市人民医院临床研究中心，江苏 无锡 214194)

Parkin基因表达对过氧化氢致线粒体损伤的保护作用

常春艳 平锋锋 洪善超1王晓明2

(无锡市人民医院临床研究中心，江苏 无锡 214194)

目的探讨Parkin对过氧化氢(H2O2)引起的氧化应激反应中线粒体稳态的调节机制。方法应用Western印迹检测H2O2损伤的SH-SY5Y细胞不同时间内源Parkin的表达；构建pcDNA 3.1Parkin WT质粒，并转染Hela细胞；应用流式细胞仪检测JC-1染色，并计算线粒体膜电位变化；应用RT-PCR技术检测线粒体促分裂因子hfis1 mRNA水平。结果在H2O2损伤3、6 h的SH-SY5Y细胞中Parkin蛋白水平升高，Hela细胞中，Parkin蛋白的表达可以抑制H2O2引起的线粒体膜电位降低，促进线粒体分裂因子hfis1 mRNA的增加。结论Parkin参与细胞的氧化应激反应，其蛋白的表达可以抑制H2O2引起的线粒体异常，维持线粒体稳态。

Parkin；帕金森病；线粒体稳态

帕金森病(PD)是最常见的慢性神经系统退行性病变之一。迄今为止已经克隆或在染色体上定位了三个常染色体隐性PD相关基因〔1〕，Parkin(PARK2)突变最常见〔2〕，该基因编码的蛋白具有泛素E3连接酶活性，除了通过泛素蛋白酶体系统参与底物降解，Parkin还在信号传导、DNA修复、氧化应激和线粒体稳态等多方面发挥重要作用〔3，4〕。目前研究显示遗传因素和氧化应激均可引起线粒体功能失调并参与PD发生〔4，5〕。Parkin参与线粒体稳态调节的机制仍不明确，本实验探讨Parkin对过氧化氢(H2O2)引起的氧化应激反应中线粒体稳态的调节机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 SH-SY5Y细胞系购自中科院细胞所；Hela细胞为本实验室保存。pcDNA 3.1-myc-his(-)A载体购自Invitrogen公司；E.Coli-DH5α为本实验室保存。限制性内切酶HindⅢ 和BamHⅠ(Fermentas公司)，兔抗-GAPDH(Sigma)，鼠抗Parkin(Cell Signal)，辣根过氧化物酶(HRP)抗鼠、抗兔IgG(上海钰森生物)，JC-1/线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，逆转录试剂盒(Fermentas公司)，qPCR Master Mix (BIONEER公司)。CO2培养箱购自德国Heraeus公司，Heal Force生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公司，免疫印迹的全套设备和MiniOpticonTMRT-PCR检测系统购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪FACSCanto Ⅱ购自美国BD公司。

1.2细胞培养 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，宫颈癌细胞Hela细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3重组质粒pcDNA3.1(-) Parkin WT构建 设计并合成的Parkin引物序列为：正义链5′CCGGAATTCGCCACCATGATAGTGTTTGTCAGGTTC3′，反义链5′CGCGGATCCCACGTCGAACCAGTGGTCC3′，在引物中引入EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切酶切位点，用此引物从cDNA文库中克隆全长Parkin基因片段，经双酶切后连入pcDNA3.1(-)载体中，连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含氨苄西林的LB平板培养基上，挑选阳性菌落进行菌落PCR检测，提质粒进行双酶切初步鉴定，筛选出的阳性菌株送上海美吉生物公司测序。测序结果与GenBank中源基因比对，确定序列正确无误。

1.4蛋白提取及Western印迹检测 将SH-SY5Y细胞接种于60 mm培养皿中，培养至汇合度达到70%后，加入100 μmol/L H2O2分别处理0，3，6，12 h。收集细胞并加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解细胞，收集裂解液并加入5倍上样缓冲液，沸水浴10 min热变性蛋白。根据目的蛋白分子量配制10%分离胶和5%浓缩胶，将蛋白样品和蛋白Marker 加入上样孔内。电泳后半干法将蛋白转到PVDF膜上，然后将PVDF膜浸泡于5%脱脂奶粉Tris盐酸缓冲溶液(TBS)中，室温摇晃封闭1 h；一抗中室温摇晃2 h或者4℃孵育过夜，GAPDH和Parkin的稀释比例分别为1∶10 000和1∶1 000；二抗室温孵育1 h，化学发光液处理后于暗室显影。

1.5线粒体膜电位检测 取对数生长期的Hela细胞，以5×104个/cm2的密度接种于24孔板过夜。加入JC-1荧光染料(终浓度50 μmol/L)继续37℃孵育30 min，DMEM洗细胞三遍。4℃离心3～4 min，沉淀细胞。然后JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次。再用100 μl JC-1染色缓冲液(1×)重悬后，流式细胞仪分析。红光激发光波长579 nm，最大发射波长599 nm，绿光激发光波长490 nm，最大发射波长516 nm，实验重复三次。

1.6PCR引物设计 根据GenBank中的基因序列设计RT-PCR引物，由上海生工合成。GAPDH 的扩增引物：上游引物5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3′；下游引物5′-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3′；hfis1扩增引物：上游引物5′-AAAGGGAGCAAGGAGGAACA-3′；下游引物5′-TGGGGCTCTGTCTGCAGCAA-3′。

1.7RT-PCR法检测hfis1 mRNA表达 Trizol提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，然后加入目的基因引物进行PCR扩增，94℃预变性10 min，94℃变性20 s，55℃退火35 s，共计35个循环，4℃终止反应。扩增结束后，根据设定的阈值获得 Ct 值并计算出相对的目的基因表达量=2-△△Ct。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1重组pcDNA3.1(-) Parkin WT表达载体鉴定 重组后的质粒经双酶切和菌落PCR法鉴定，结果为阳性的菌株送上海美吉公司测序，测序结果经Blast与GenBank中源基因比对，序列完全正确。

2.2H2O2处理的SH-SY5Y细胞中内源性Parkin蛋白的表达 Western印迹(图1)检测显示，3 h组(2.697±0.401)和6 h组(1.697±0.327)Parkin蛋白明显高于0 h组(1.055±0.347)(Plt;0.05)，12 h组(1.355±0.426)与0 h组无统计学差异(Pgt;0.05)。

图1 100 μmol/L H2O2处理不同时间对内源性Parkin表达的影响

2.3线粒体膜电位变化 H2O2处理组相对荧光比值(221.597±69.210)明显高于对照组(104.257±25.381)和过表达Parkin的H2O2处理组(137.697±34.526)(Plt;0.05)；对照组和过表达Parkin的H2O2处理组间无统计学差异(Pgt;0.05)。

2.4hfis1 mRNA表达 H2O2处理组中hfis1 mRNA水平(130.137±4.385)明显高于对照组(102.107±3.255)和过表达Parkin的H2O2处理组(57.184±4.252，Plt;0.05)；对照组hfis1 mRNA水平低于过表达Parkin的H2O2处理组(Plt;0.05)。

3 讨 论

H2O2损伤可以使线粒体及细胞内蛋白质、脂类及核酸的氧化，最终导致线粒体功能下降。线粒体能量合成出现障碍，进一步造成细胞内外离子失衡和膜电位下降，引起线粒体内膜通透性改变。诱发细胞色素(Cyt)C从线粒体释放到细胞质中。Cyt C可以与凋亡激活因子-1及pro-caspase-9 形成凋亡小体，活化Caspase途径，进一步导致线粒体膜破裂，从而引发神经细胞凋亡〔6〕。本研究结果提示Parkin可能参与H2O2细胞应激过程。这一结果与之前的研究发现氧化应激时Parkin转录促进子活性增强，特异性激活Parkin转录，从而其蛋白水平上升相一致〔7〕。Parkin蛋白还可以作为泛素E3连接酶，通过泛素一蛋白水解酶系统其底物及自身蛋白泛素化，阻止氧化损伤蛋白的毒性聚集，可有效清除细胞内垃圾蛋白积累产生的细胞毒性〔3〕。这可以解释我们在无内源Parkin表达的Hela细胞中外源引入Parkin质粒并表达该蛋白后发现，Parkin蛋白的表达可以抑制过氧化氢引起的线粒体膜电位降低和促线粒体分裂蛋白hfis1 mRNA的增加。本研究提示，Parkin蛋白可以通过调节hfis1基因转录参与应对氧化应激损伤并维持线粒体稳态。然而，Parkin对Hfis1的更深入调节机制仍需要进一步的实验验证。

1Bekris LM，Mata IF，Zabetian CP.The genetics of Parkinson disease〔J〕.J Geriatr Psychiatry Neurol，2010；23(4)：228-42.

2Rakovic A，Grunewald A，Seibler P，etal.Effect of endogenous mutant and wild-type PINK1 on Parkin in fibroblasts from Parkinson disease patients〔J〕.Hum Mol Genet，2010；19(16)：3124-37.

3Kubli DA，Quinsay MN，Gustafsson AB.Parkin deficiency results in accumulation of abnormal mitochondria in aging myocytes〔J〕.Commun Integr Biol，2013；6(4)：e24511.

4Cookson MR.Parkinsonism due to mutations in PINK1，parkin，and DJ-1 and oxidative stress and mitochondrial pathways〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Med，2012；2(9)：a9415.

5Seet RC，Lee CY，Lim EC，etal.Oxidative damage in Parkinson disease：measurement using accurate biomarkers〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(4)：560-6.

6Perl A，Nagy G，Gergely P，etal.Apoptosis and mitochondrial dysfunction in lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Methods Mol Med，2004；102：87-114.

7Tan EK，Puong KY，Chan DK，etal.Impaired transcriptional upregulation of Parkin promoter variant under oxidative stress and proteasomal inhibition：clinical association〔J〕.Hum Genet，2005；118(3-4)：484-8.

〔2016-10-08修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R742.5

A

1005-9202(2017)21-5273-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.024

无锡市人民医院一研一题基金项目(No.TY201307)

1 无锡市人民医院检验科 2 无锡市人民医院神经内科

王晓明(1973-)，男，副主任医师，博士，主要从事帕金森病病因及临床治疗研究。

常春艳(1981-)，女，助理研究员，博士，主要从事帕金森病分子生物学研究。