孟鲁司特钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠NF-κB、TNF-α mRNA表达的影响

胡建英 王雅敏 李峤坷

(武警四川总队医院呼吸科，四川 成都 614000)

孟鲁司特钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠NF-κB、TNF-α mRNA表达的影响

胡建英 王雅敏 李峤坷1

(武警四川总队医院呼吸科，四川 成都 614000)

目的探讨孟鲁司特钠对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠核因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子-α信使核糖核酸(TNF-α mRNA)表达的影响。方法选购清洁级SD成年雄性大鼠24只，以薰香烟法和气管注入脂多糖建立COPD大鼠模型，按随机数字表法分为模型组和用药组各12只。模型组给予10 ml/kg生理盐水灌胃，1次/d；用药组给予0.2 ml孟鲁司特钠灌胃，1次/d，两组均连续灌胃4 w。末次给药结束，检测两组支气管肺泡灌洗液白细胞总数和中性粒细胞(PMN)、单核巨噬细胞(AM)绝对计数及NF-κB、TNF-α、TNF-α mRNA表达情况。结果与模型组相比，用药组白细胞总数、PMN、AM计数较低(Plt;0.05)；模型组与用药组TNF-α表达强度分别为(3.30±0.51)、(2.70±0.67)，NF-κB表达强度分别为(2.90±0.61)、(2.30±0.71)，差异有统计学意义(Plt;0.05)；用药组TNF-α mRNA表达(0.50±0.07)低于模型组(0.63±0.09)(Plt;0.05)。结论孟鲁司特钠治疗COPD模型大鼠，能抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表达，孟鲁司特钠对COPD具有一定的疗效。

慢性阻塞性肺疾病；孟鲁司特钠；肿瘤坏死因子-α mRNA；核因子-κB

目前尚不十分明确慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制，其以肺血管、肺实质、气道的慢性炎症为特征，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞增加，造成炎症细胞激活而释放多种细胞因子和介质，促进中性粒细胞炎症反应和破坏肺结构〔1〕。有害气体或颗粒、烟雾等均会造成肺部抗氧化、氧化及抗蛋白酶、蛋白酶的失衡，吸烟能诱导炎症，造成肺脏损伤，吸入有害气体或颗粒会引起肺部炎症，与COPD的发病有密切联系〔2〕。孟鲁司特钠为白三烯受体拮抗剂，能避免白三烯和受体相结合，能缓解气道痉挛，抑制气道炎症，减轻气道阻塞，降低气道高反应性；能促进淋巴细胞凋亡，对气道淋巴细胞核因子(NF)-κB的激活起到抑制作用〔3〕。本研究探讨孟鲁司特钠对COPD模型大鼠NF-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验器材 上海精益医用器材厂提供的血球计数板；购自香港华粤企业公司的UNIVERSAL 16R低温离心机；Olympus显微镜；郑大二附院气管镜室提供的灌肺气管插管针。

1.2实验药品、试剂 北京中杉金桥公司的鼠抗NF-κB克隆抗体；武汉博士德生物工程有限公司的兔抗鼠TNF-α多克隆抗体；瑞氏(Wright)染液；Solarbio 公司的磷酸盐缓冲液；沙河牌香烟购自郑州卷烟厂，烟碱量为12 mg，焦油量为15 mg；脂多糖购：美国Sigma公司，货号：Sigma-L2880，规格：10 mg，纯度：≥99%；孟鲁司特钠购自鲁南贝特制药有限公司，国药准字H20083330，规格：5 mg，纯度：99%。

1.3实验动物 选取清洁级SD成年雄性大鼠24只，12周龄，体重210～250 g，平均(230.21±13.75)g，合格证号SCXK(京)2009-0007，均购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养于温度为19℃～25℃、湿度为55%～65%的环境下，每日光照10～12 h，噪音lt;60 dB，每周进行2次清洗消毒鼠笼，自由饮食、饮水，适应性喂养1 w后开始实验。本实验已通过动物研究委员会同意。

1.4分组和制备模型 采用随机数字表法将常规喂养1 w的24只大鼠分为模型组和用药组各12只。在实验第1天和第15天将200 μg脂多糖向大鼠器官内缓慢注入，实验第2～14天和第16～32天分别将大鼠置于自制的600 cm×30 cm×40 cm的烟熏箱中进行被动吸烟，2次/d，10支/次，60 min/次，两次之间需间隔≥2 h。被动吸烟完成后，将大鼠放回原饲养笼中饲养，待大鼠出现活动明显减少、偶有咳嗽、食欲下降、喘息等症状时，即造模成功。

1.5给药方法 模型组大鼠在造模后每日接受10 ml/kg生理盐水灌胃，1次/d，不给予其他任何处理。在25 ml注射用生理盐水中加入1 g孟鲁司特钠中进行稀释，备用。用药组大鼠在造模后每日给予0.2 ml(6 mg/kg)孟鲁司特钠灌胃，1次/d，两组均连续灌胃4 w。

1.6检测方法

1.6.1支气管肺泡灌洗液的制备 所有动物在最后一次用药后48 h内进行颈椎脱臼法处死，分离气管，将右肺支气管结扎，以“T”形切口将气管插管插入左肺支气管，并将3 ml生理盐水经气管插管缓慢注入，保留3 min后将其吸出，以单层纱布过滤，反复4次，回收支气管肺泡灌洗液。

1.6.2细胞计数及分类 擦拭干净血球计数板，将盖玻片盖上，用毛细血管吸取制备的支气管肺泡灌洗液，经上侧面加入血球计数板，放入显微镜下，计数全部细胞。计数的全部×2×1/4×10 000=细胞数；细胞数×支气管肺泡灌洗液毫升数=支气管肺泡灌洗液中的细胞总数。取支气管肺泡灌洗液12 ml，4℃ 2 000 r/min离心8 min，取适量沉渣涂片。以瑞氏染色法染色：在灌洗液涂片区滴满染液，2 min后滴加pH6.4磷酸盐缓冲液，切勿溢出染色区，染色5～10 min后，将染液以流水冲洗掉，将玻片晾干。镜检300个细胞分类计数，计算中粒细胞和巨噬细胞所占百分比，在计算出某种细胞在支气管肺泡灌洗液中的总数。

1.6.3肺组织标本制作 将左主支气管夹闭，在右主支气管内固定硅胶管，在右肺内注入10%甲醛，至其膨胀、边缘变锐。结扎右主支气管扎并浸入10%甲醛、固定。14 d内实施脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色。

1.6.4SP法免疫组化检测 将浸泡玻片以清洁剂刷洗，以流水冲净后烤干，泡酸1 d并再次冲净、烤干，以95%酒精浸泡12 h后烤干，再采用多聚赖氨酸浸泡并烤干。苯脱蜡，梯度酒精脱苯，并用蒸馏水清洗3 min，重复3次，以磷酸盐缓冲液清洗5 min，滴加3%氧化氢试剂A。将其置于室温下30 min，将内源性过氧化物酶去除，以磷酸盐缓冲液清洗3 min，重复3次。在抗原修复液的容器中浸入切片，在温度为98℃～100℃的微波炉中加热7 min，操作2次，加热后冷却30 min于室温环境下，用磷酸盐缓冲液清洗3 min，重复3次。滴加正常山羊血清封闭液试剂B，置于室温下孵育30 min。将多余液体甩去，滴加1∶50稀释的一抗(兔抗鼠TNF-α多克隆抗体或鼠抗NF-κB克隆抗体)，于4℃下过夜。而后将其置于37℃下复温45 min，用磷酸盐缓冲液清洗3 min，重复3次。滴加50 μl Ⅱ抗试剂C，用磷酸盐缓冲液清洗3 min，重复3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素染色试剂盒内试剂D，用磷酸盐缓冲液清洗3 min，重复3次。DAB显色，时间5～10 min，随后将其置于流水下冲洗10 min，终止反应。苏木素衬染90 s，兰化5 min，盐酸酒精分化10 s(30%盐酸与75%酒精，体积比为1∶100)，水冲5 min，脱水、透明、封片。将其置于显微镜下观察。以已知阳切片为阳性对照；以磷酸盐缓冲液为阴性对照。以定位明确都的背景清晰、棕黄色细胞为阳性细胞计数，以连续切片400倍视野的HE染色结果计数视野细胞数10个，参考切片免疫组化结果，记录NF-κB和TNF-α表达情况。每张切片随机选择5个视野于高倍镜下，半定量分析表达强度。0分：未着色，1分：阳性细胞lt;总数25%，2分：弥漫性着为色弱阳性，3分：弥漫性着色为中等强度，4分：弥漫性着色为强阳性。

1.6.5RT-PCR法检测 按美国Tripure RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA提取，按大连宝生物RT-PCR剂盒操作说明进行RT-PCR提取。PCR扩增条件：2 min 94℃预变性，0.5 min 94℃变性，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min。循环28个后，72℃再延伸8 min。经琼脂糖电泳PCR产物后，以凝胶扫描仪进行NDA电泳条带光量子强度分析，以β-actin DNA电泳条带光量子强度和TNF-α电泳条带光量子强度比值为TNF-α mRNA 表达水平参数。由上海博亚公司合成引物。β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTCAGACCTTCA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，PCR扩增片段长度312 bp；TNF-α上游引物：5′-ACCCAAGCTTATGCACGGAAAGCATGATC-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTCACAGAGCAATGACTCCAA-3′，PCR扩增片段长度725 bp。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组支气管肺泡灌洗液白细胞总数和PMN、AM计数比较 与模型组相比，用药组白细胞总数、PMN、AM计数显著降低(Plt;0.001)。见表1。

2.2两组TNF-α、NF-κB表达强度比较 与模型组相比，用药组TNF-α、NF-κB表达强度显著降低(Plt;0.001)。见表2，图1。

2.3两组TNF-α mRNA表达比较 与模型组(0.63±0.09)相比，用药组TNF-α mRNA表达(0.50±0.07)显著降低(t=21.558,P=0.000)。

表1 两组支气管肺泡灌洗液白细胞总数和PMN、AM计数比较

表2 两组 TNF-α、NF-κB表达强度比较

图1 NF-κB免疫组化染色(×200)

3 讨 论

反复不断的气道感染和吸烟史是COPD发生与发展的主要原因，烟雾中含有大量的有害物质，如甲醛、氢氰酸、丙烯醛等，是氧化物的主要来源〔4〕。氧化物能促使组织产生炎症细胞，会直接损伤肺组织，促使多种炎症细胞浸润肺间质和肺泡腔，而炎症细胞能产生氧化物，诱导肺组织分泌、合成炎症介质并损伤肺组织，形成恶性循环〔5,6〕。此外，香烟中的烟雾能造成下呼吸道对细菌感染的易感性增加，加重支气管和肺损伤，对病变进展起到促进作用。脂多糖在内毒素对机体起致病性方面发挥重要的作用，其能促使中性粒细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞等释放炎症因子，介导肺组织和气道炎症反应〔7,8〕。

TNF-α为炎性介质，能经诱导多种细胞因子并与其相互协同，促进炎症反应；能造成中性粒细胞被激活，使其吞噬功能增强〔9〕。TNF-α的大量释放和慢性刺激会造成组织免疫病理损伤。TNF-α过度表达会加重肺组织损伤，引起炎症反应的慢性化〔10〕。NF-κB为DNA结合蛋白，能调控免疫细胞、肺炎症和气道上皮细胞中的黏附分子、细胞因子及趋化因子等的基因表达，参与肺部的免疫及炎症反应〔11〕。COPD气道炎症的发生发展与NF-κB的活化有密切关系。TNF-α能增强气道巨噬细胞、上皮细胞和肺组织中NF-κB活性。激活后的NF-κB，会促使炎症细胞因子mRNA转录，而合成TNF-α、白介素-8等炎性细胞因子〔12〕。上述炎症因子能使炎症细胞活化，对炎性细胞的释放、合成炎性介质发挥促进作用。本研究说明孟鲁司特钠能降低抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表达，对COPD具有一定的疗效。孟鲁司特钠能竞争性的与白三烯受体结合，能经减少激活的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和细胞素、肥大细胞等炎症标志物，降低气道的高反应性〔13〕。其主要作用机制包括：①对气道内脱颗粒和嗜酸粒细胞浸润发挥抑制作用，避免细胞-EOS发挥作用；②对气道上皮细胞生长因子受体表达起抑制作用，避免杯状细胞化生；③避免LTD4刺激平滑肌细胞分裂〔14，15〕。孟鲁司特钠能避免气道内聚集炎症细胞，抑制巨噬细胞过氧化物、嗜酸粒细胞阳离子蛋白等炎症介质释放，发挥改善患者肺功能、减轻气道炎症等作用。本研究仍存在一定的不足之处，如研究样本量较少，未分析孟鲁司特钠的作用强度是否与用药剂量有关等，后期仍需深入研究。

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〔2017-04-26修回〕

(编辑 滕欣航)

R563

A

1005-9202(2017)21-5264-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.020

1 武警四川总队医院ICU

胡建英(1967-)，女，副主任医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病的研究。