参叶缓痴胶囊对SHSY5Y细胞凋亡的作用

2017-11-28张明天张永和张莲珠

中国老年学杂志 2017年21期

关键词：冈田存活率胶囊

张明天张永和张莲珠

(长春中医药大学附属医院中医药研究中心，吉林长春 130021)

参叶缓痴胶囊对SHSY5Y细胞凋亡的作用

张明天张永和张莲珠

(长春中医药大学附属医院中医药研究中心，吉林长春 130021)

目的探讨参叶缓痴胶囊(SYHC)改善认知功能障碍(CI)作用的相关机制。方法MTT法观察SYHC对细胞增殖的影响，不同浓度冈田酸诱导下细胞的存活率及冈田酸IC50的确定。流式细胞技术检测细胞凋亡及SYHC对冈田酸致神经细胞凋亡后的保护作用。酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中相关神经介质的含量及酶的活性。结果结论SYHC对神经元细胞具有促增殖作用，能够保护神经细胞，降低冈田酸对其造成的损伤，并对已受损的神经细胞具有一定的修复作用。其作用途径可能是从维持细胞胆碱能水平、避免细胞tau蛋白过度磷酸化及调控细胞凋亡相关基因表达等方面来实现的。

参叶缓痴胶囊；认知功能障碍；冈田酸；tau 蛋白

认知功能障碍(CI)主要包括感知觉障碍、思维障碍、注意障碍、记忆障碍、智能障碍等。重者达到痴呆的程度，轻者则表现为CI，其中轻者具有早期干预的价值。CI是介于正常老化和老年痴呆(AD)之间的一种临床状态，CI代表AD的早期阶段，由于CI在临床上处于可逆期，如果在CI阶段能给予治疗及干预可大大降低AD发病率。参叶缓痴胶囊(SYHC)由淫羊藿、人参、银杏叶等组成，临床治疗CI疗效显著。乙酰胆碱(Ach)是一种重要的神经递质。其主要功能是能够促进激活脑神经传导功能，提高信息传递速度，增强大脑记忆能力，全面改善脑功能并能延缓衰老。tau蛋白是一种低分子量的微管相关蛋白，当tau蛋白发生高度磷酸化时则失去对微管的稳定作用，导致神经纤维退化，从而引起神经功能失调及神经细胞凋亡。本文以冈田酸损伤神经细胞作为模型，初步探究该药改善CI的作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞来源于中国科学院细胞库。

1.2试剂 SYHC(长春中医药大学附属医院制剂中心)，低糖DMEM培养基、胰酶(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)、DMSO、冈田酸(SIGMA公司)，细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)，ACH、chAT、AchE、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF及p-tau试剂盒(RD公司)。

1.3仪器 BD FACS Calibur流式细胞仪(美国 BD)，INFINITE M200酶标仪(瑞士TECAN)，IX71倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS)，Mili Q超纯水器(美国Millipore)，3111二氧化碳培养箱(美国 THERMO)，SW-CJ-1F 超净台(上海博迅实业有限公司)等。

1.4细胞培养 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞培养于10% FBS的DMEM低糖培养基中，37℃，饱和湿度，5% CO2温箱培养。每周更换3次培养基，0.125%胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹打形成细胞悬液进行传代培养。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结果

2.1SYHC对SH-SY5Y细胞存活率的影响参叶缓痴胶囊与SH-SY5Y神经细胞共孵育24 h，在 6.25～100 μg/ml浓度范围内具有细胞增殖作用。对照组细胞存活率为(100.1±4.33)%，随着浓度的增加，其增殖效果逐渐加强，其中6.25 μg/ml细胞存活率(100.4±1.16)%，12.5 μg/ml细胞存活率(100.8±4.35)%，25 μg/ml细胞存活率(105.7±4.35)%，50 μg/ml细胞存活率(113.7±2.41)%，100 μg/ml细胞存活率(119.3±3.40)%。但浓度高于100 μg/ml时，SYHC对神经细胞的促增殖作用逐渐减缓，200 μg/ml时，细胞存活率为(110.7±2.15)%。

2.2冈田酸致细胞损伤IC50的测定冈田酸可诱导SH-SY5Y细胞凋亡，具有显著杀伤作用，其杀伤效力具有浓度依赖性，且作用效果与时间具有正相关性，冈田酸320 nmol/L作用48 h，细胞存活率为19.7%，通过拟合曲线，计算其IC50为80 nmol/L，见表1。通过显微镜察不同浓度冈田酸诱导SH-SY5Y细胞48 h后，细胞形态发生显著变化。对照组(A)细胞呈三角形或多角形，轴突清晰，胞膜完整光滑，随着冈田酸浓度的增加(B～F)，细胞逐渐皱缩，胞质及胞核浓缩，细胞间接触消失。见图1。

表1 冈田酸对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞存活率的影响

与0 nmol/L比较：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

A.对照组;B～F：冈田酸浓度分别为20、 40、 80、 160、 320 nmol/L图1 与冈田酸共孵育48 h 后SH-SY5Y细胞形态(×100)

2.3SYHC对SH-SY5Y细胞的保护与修复当细胞在与SYHC共同孵育12 h后，加入损伤因子冈田酸(80 nmol/L)，继续培养48 h，SYHC对SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用。其中对照组细胞存活率(100.0±16.0)%，模型组细胞存活率(54.6±8.7)%，12.5 μg/ml细胞存活率(56.6±5.1)%,25 μg/ml细胞存活率(64.4±5.3)%,50 μg/ml细胞存活率(69.8±2.5)%,100 μg/ml细胞存活率(83.3±4.2)%。

经过损伤因子冈田酸(80 nmol/L)损伤后的SH-SY5Y细胞，在SYHC 12.5～100 μg/ml的浓度下，对其具有一定的修复作用。其中对照组细胞存活率(100.0±1.3)%，模型组细胞存活率(48.4±2.0)%，12.5 μg/ml细胞存活率(49.0±0.7)%,25 μg/ml细胞存活率(51.8±0.8)%,50 μg/ml细胞存活率(61.2±3.2)%,100 μg/ml细胞存活率(62.5±6.6)%。

2.4流式细胞仪检测冈田酸致SH-SY5Y细胞的凋亡情况与对照组(0.02%±6.44%)比较，冈田酸20、40、80、160、320 nmol/L组细胞凋亡率(5.13%±0.68%、23.72%±1.06%、51.38%±1.78%、65.99%±0.94%、82.28%±0.70%)逐渐增加，表明冈田酸可以造成细胞凋亡。在冈田酸浓度为80 nmol/L时，细胞凋亡率为51.38%，确定此浓度为后续实验中神经元细胞损伤浓度。

2.5流式细胞仪检测参叶缓痴胶囊对SH-SY5Y细胞凋亡的保护情况与模型组(45.40%±8.76%)比较，参叶缓痴胶囊25、50、100 μg/ml组细胞凋亡率(35.61%±5.39%、30.18%±2.56%、16.62%±4.26%)降低(Plt;0.05)，表明参叶缓痴胶囊对冈田酸致SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用。另外，对照组为0.03%±16.09%，12.5 ng/ml组为43.40%±5.12%。

2.6参叶缓痴胶囊对冈田酸诱导SH-SY5Y细胞胆碱能异常的影响与对照组比较，冈田酸致SH-SY5Y细胞损伤模型组细胞Ach含量明显降低(Plt;0.001)，ChAT含量减少(Plt;0.001)，AchE酶活力明显升高(Plt;0.001)。与模型组比较，参叶缓痴胶囊50、100 μg/ml给药组SH-SY5Y细胞Ach含量增加(Plt;0.001)，25、50、100 μg/ml给药组SH-SY5Y细胞ChAT含量增加(Plt;0.05，Plt;0.01)，AchE活力降低(Plt;0.01)。见表2。

2.7参叶缓痴胶囊对冈田酸诱导SH-SY5Y细胞凋亡基因的影响与对照组比较，冈田酸模型组Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显减少(Plt;0.001)。与模型组比较，参叶缓痴胶囊50、100 μg/ml组细胞Bax蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量增加(Plt;0.05)，Bax/Bcl-2比值降低。见表3。

2.8参叶缓痴胶囊对冈田酸诱导SH-SY5Y细胞磷酸化tau蛋白含量的影响冈田酸造成SH-SY5Y细胞损伤时，细胞液中p-tau的含量明显增加(Plt;0.001)。与模型组〔(3.08±0.07)pg/ml〕比较，参叶缓痴胶囊50、100 μg/ml给药组〔(2.78±0.12)pg/ml、(2.68±0.07)pg/ml〕细胞液中p-tau含量明显下降(Plt;0.05，lt;0.01)。对照组为(2.54±0.02)pg/ml，12.5 μg/ml组为(3.06±0.16)pg/ml，25 μg/ml组为(2.95±0.11)pg/ml。

表2 参叶缓痴胶囊增加冈田酸损伤SH-SY5Y细胞Ach、ChAT含量，抑制AchE活性

与模型组比较：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

表3 参叶缓痴胶囊对冈田酸诱导SH-SY5Y细胞Bax/Bcl-2表达变化的比较

3 讨论

CI多发病于老年人，是老年痴呆的前兆，老年人的记忆功能随着年龄的增长而逐渐衰退，记忆和认知功能减退是正常老化不可避免的现象〔1，2〕，而虚、瘀、浊、毒〔3〕是多种老年病的主要中医病理基础，也是大多数老年病的基本病机，虛为其本，瘀、浊、毒为其标，血瘀、痰浊、毒邪既是脏气虛衰的结果，又是主要的致病因素，四者相互影响，成为认知功能障碍及痴呆的复杂发病机理〔4～6〕。参叶缓痴胶囊以淫羊藿温补肾阳，补先天之本(肾)，以人参健脾益气，补后天之本(脾)，以银杏叶活血化瘀，通调血脉(心)。冈田酸是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，在一定浓度下可以抑制磷酸酯酶的活性，磷酸酯酶可以催化磷酸蛋白内的磷酸酯键水解，达到去磷酸化的目的〔7〕。本研究发现：(1)参叶缓痴胶囊对正常SH-SY5Y细胞在一定浓度范围内具有促增殖作用且浓度与细胞数量呈现正相关性。在参叶缓痴胶囊对细胞的保护作用实验中，模型组与中药治疗组比较，在50 μg/ml与100 μg/ml浓度下保护效果最为明显，提示在进一步研究参叶缓痴胶囊对SH-SY5Y细胞的保护途径时，要将作用浓度控制在100 μg/ml以下。同时参叶缓痴胶囊对SH-SY5Y细胞的保护作用强于修复作用。 (2)参叶缓痴胶囊可降低冈田酸致SH-SY5Y细胞损伤模型细胞凋亡率。(3)降低细胞凋亡基因Bax蛋白的表达含量可提高抑凋亡基因(Bcl2)蛋白表达量，Bax/Bcl-2比值降低。本研究提示结果表明，参叶缓痴胶囊可能通过抑制细胞凋亡的途径对脑细胞损伤起保护作用。(4)冈田酸可以造成神经元细胞乙酰胆碱水平下降、tau蛋白过度磷酸化、细胞凋亡基因表达异常以及神经营养因子缺失。(5)参叶缓痴胶囊改善认知功能障碍可能与其调节中枢胆碱能神经功能，促进细胞ACh合成并抑制分解有关。(6)脑内微管蛋白tau蛋白是一种分布在中枢神经系统内的低分子量含磷糖蛋白，本研究表明，参叶缓痴胶囊改善学习记忆障碍的作用可能与抵制P-tau生成有关。总之，SYHC改善CI其作用途径可能与维持细胞胆碱能水平、避免细胞tau蛋白过度磷酸化及调控细胞凋亡相关基因表达等方面有关。

1Fillit H，Evansd，Butler R，etal.Achieving and maintaining cognitive veitality with wing〔J〕.Mayo Clin Proc，2002;77(7)：681-967.

2Chertkow H，Bergman H，Schipper HM，etal.Assessment of suspected dementia〔J〕.Can J Neurol Sci,2001;28(suppll)：S28-S41.

3李浩，姚明江.浅谈中医“虛”、“瘀”、“浊”、“毒”与轻度认知障碍发病的关系〔J〕.中国中医药信息杂志，2006；3(11) ：4-5.

4王江山，周文泉.治疗老年性痴呆临床经验〔J〕.中医研究，2000;13(4)：18-9.

5赵冰，张华东，张晨，等.谢海洲治疗老年性痴呆经验〔J〕.中医杂志，2006;47(4)：258-9.

6顾蔚，侯晓薇，刘鑫，等.对经基苯甲酸丙醋对果蝇寿命及超氧化物歧化酶、丙二酸的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(20)：2968-70.

7Fernandez JJ，Candenas ML，Souto ML，etal.Okadaic acid，useful tool for studying cellular processes〔J〕.Curr Med Chem，2002;9(2)：229-62.

〔2017-09-11修回〕

(编辑郭菁)

R285.5

1005-9202(2017)21-5255-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.017