黑曲霉xynC基因编码一种低温酸性木聚糖酶

焦丛蕊，杨文娟，陈晓玲，董自星，金鹏，刘晓光，王正祥, *

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)2(天津科技大学 化工与材料学院，天津，300457)

黑曲霉xynC基因编码一种低温酸性木聚糖酶

焦丛蕊1，杨文娟1，陈晓玲1，董自星2，金鹏2，刘晓光2，王正祥1, 2*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)2(天津科技大学 化工与材料学院，天津，300457)

木聚糖酶(xylanase, EC 3.2.1.8)可以随机切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，在饲料、食品、造纸和纺织等领域具有广泛的应用。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510来源的木聚糖酶基因xynC在毕赤酵母中进行了克隆表达，构建获得了重组菌GS115 (pPIC-XynC)。在摇瓶水平上，重组菌的酶活为1.14 U/mL。酶学性质的研究表明，重组酶XynC的最适反应温度和pH分别为30 ℃和2.5，且它在25～40 ℃或pH 2.0～5.0有较好的稳定性；K+对XynC的活性有微弱的促进作用，而Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+、EDTA和SDS等对XynC的活性有不同程度的抑制作用。此外，该酶还可以水解戊聚糖产生聚合度为3～6的低聚木糖。这些良好的理化性质为重组酶XynC在饲料及食品等领域的应用奠定了基础。

低温酸性木聚糖酶；黑曲霉；分子克隆；酶学性质；低聚木糖

内切-1,4-β-D-木聚糖酶，简称木聚糖酶(xylanase，EC 3.2.1.8)，是降解木聚糖的关键酶，它可以随机切割主链的β-1,4-糖苷键，从而产生不同长度的低聚木糖[1]。该酶广泛应用于饲料、食品、造纸、纺织以及能源等诸多工业领域[2-3]。当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得[4]。而国内主要由真菌经固态发酵生产木聚糖酶，其酶活较低，且成分复杂，限制了木聚糖酶的广泛应用。因此，通过分子克隆技术实现木聚糖酶的异源表达成为近年来的研究热点。目前已有多种木聚糖酶被克隆及表达，其中黑曲霉来源的XynB[5-7]和XynI[8-10]已经在毕赤酵母、黑曲霉和大肠杆菌等多种宿主中得到了克隆表达，它们的酶学性质也被系统地解析。

尽管黑曲霉CBS 513.88的基因组序列已经于2007年被解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白数据库中还有许多蛋白的功能未确定。本课题组前期通过对其基因组序列信息进行分析，发现了一个新的编码木聚糖酶的基因xynC，其理化性质与功能等未知。为此，本研究通过分子克隆技术将其在毕赤酵母中进行克隆表达，并对其进行了初步纯化，还就其生化特征进行了全面解析，为其大规模生产及其在饲料及食品行业的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1菌种

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0510为从自然样本中分离保藏的野生菌株，由本实验室保藏[12]。重组毕赤酵母菌GS115 (pPIC-XynC)由本研究中构建、筛选并保存。大肠杆菌JM109由本实验室保藏。黑曲霉采用CD培养基进行培养；大肠杆菌用LB培养基进行培养；毕赤酵母及其重组菌的培养基及其培养方法按照Invitrogen的毕赤酵母操作手册进行。

1.2主要试剂

限制性酶、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒以及胶回收试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；G418、无氨基酵母氮源等为Invitrogen公司产品；RNA抽提试剂盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成试剂盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)由Roche公司提供；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等购于英国OXOID公司；戊聚糖购自陕西帕尼尔生物科技有限公司；D-木糖和低聚木糖为江苏锐阳生物科技有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.3黑曲霉木聚糖酶基因XynC的克隆与表达

1.3.1 毕赤酵母工程菌的构建

质粒、PCR产物的纯化、酶切、连接、电转化以及转化子筛选等均采用实验室常规方法[13]。其中，基因克隆过程中所采用寡核苷酸引物(An-XynC1：GTACTCCCCAATGGCAAGGCCC；An-XynC2：TGCTC￣T￣A￣G￣A￣TTAGCAGCTCTCCTCGGTGCTGTC；下划线部分为人工引入的限制性酶切位点)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。黑曲霉总RNA的提取与cDNA的制备按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 重组酶的诱导分泌表达与初步纯化

将毕赤酵母重组菌GS115(pPIC-XynC)在YPD平板上进行纯化，挑取单菌落接种于25 mL YPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期(OD600为2～6，约18～20 h)。按1%(v/v)接种量接入50 mL BMGY培养基中，于30 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期(OD600为2～6，约16～18 h)。室温下5 000 r/min离心5 min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0，30 ℃继续培养并开始诱导。每隔24 h补加100%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导，并同时取样测定酶活，直至酶活不再提高。

发酵结束后，离心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)收集粗酶液。采用盐析、透析和Sephadex G-75凝胶层析柱对其进行初步纯化，并通过酶活测定和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电脉(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白的纯化情况。[14]采用5%的浓缩胶，12%的分离胶。

1.4重组木聚糖酶的酶学特征分析

1.4.1 酶活测定方法

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[15]测定木聚糖酶的酶活。反应体系为200 μL 50 g/L戊聚糖溶液、300 μL相应pH的缓冲液和100 μL经适当稀释的酶液，在50 ℃反应30 min后，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液终止反应。离心后，取400 μL反应上清液，加入400 μL去离子水和1 mL DNS试剂，沸水浴5 min后，迅速冷却。再用去离子水定容到5 mL，测540 nm下的吸光值；对照组中预先加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液灭酶活，然后于上述条件下反应，测定吸光度。酶活力定义：1 mL酶液在50 ℃、pH 5.5条件下，每分钟水解戊聚糖生成1 mg还原糖为1个酶活力单位(U)，用U/mL表示。

1.4.2 最适反应温度的测定

在不同温度条件下(25～70 ℃)测定重组木聚糖酶的酶活，以酶活最高者为100%表示所处温度下的相对酶活。

1.4.3 热稳定性的测定

分别将木聚糖酶的酶液在不同温度下(25～70 ℃)进行孵育，于不同时间(15、30、60和120 min)取样，测定重组木聚糖酶的酶活。以未进行热处理的酶液的酶活为100%，计算相对酶活，确定重组木聚糖酶的热稳定性。

1.4.4 最适反应pH的测定

在不同反应pH下(pH 2.0～8.0)测定重组木聚糖酶的酶活，以酶活最高者为100%表示所处pH下的相对酶活。所用缓冲液为：pH 2.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

1.4.5 pH稳定性的测定

室温下，分别将经过适当稀释的木聚糖酶酶液在pH 2.0～7.0的缓冲液中孵育1 h后，按照1.4.1的方法测定酶活。以酶活最高者为100%计算残余酶活力，确定重组酶的pH稳定性。

1.4.6 金属离子和相关化学试剂对酶活的影响

在木聚糖酶与其底物进行反应的体系中，加入终浓度为5 mmol/L的不同金属离子或化合物，分别测定各反应体系中重组木聚糖酶的相对酶活，以不加金属离子或化学试剂的反应体系的酶活为100%。

1.5重组酶水解戊聚糖的产物分析

1.5.1 水解实验

将200 μL 50 g/L戊聚糖溶液与100 μL酶液混匀，在最适反应温度和pH条件下反应10 h后，煮沸灭酶活。然后在12 000 r/min离心5 min，取上清液。

1.5.2 水解产物薄层层析

将上述上清液采用薄层层析进行分析。所用的展开剂为:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(异丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=25∶10∶5∶1∶15[16]，显色剂为：V(硫酸)∶V(无水乙醇)=5∶95。从左到右依次点样：木糖标品(1 mg/mL)、低聚木糖标品(1 mg/mL)、XynC与戊聚糖反应的上清液、灭活的XynC与戊聚糖反应的上清液。将已经点好样的硅胶板放入盛有适量展开剂的层析缸中，待展开剂扩散至距硅胶板上沿1 cm处，取出硅胶板，在通风厨里晾干。向此干燥的硅胶板上快速均匀的喷洒显色剂，在通风橱里晾干，然后烘烤至样品显示出来，并拍照记录。

1.6木聚糖酶基因XynC的生物信息学分析

从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取不同来源的木聚糖酶的氨基酸序列。利用MEGA 4.0等软件将XynC与这些木聚糖酶的氨基酸序列以邻近法(Neighbour-joining)构建进化树，分析它们亲缘关系的远近[17]。通过软件Clustal X2和BioEdit对不同来源木聚糖酶的氨基酸序列进行比对和分析。

2 实验结果

2.1木聚糖酶基因XynC的克隆与分析

采用BLAST等分析方法对A.nigerCBS 513.88的基因组序列(EMBL AM270980-AM270998)进行分析，发现1个新的木聚糖基因(命名为xynC)。以此为基础，设计出相应的核苷酸引物。然后以A.nigerCICIM F0510的cDNA为模板对其进行PCR扩增。PCR产物经纯化后，用XbaI进行完全酶切，并与经过SnaB I和AvrII酶切的pPIC9K进行连接。再通过PstI酶切，验证了重组质粒的正确性，获得了重组表达质粒pPIC-XynC。进一步通过核苷酸序列测定，确认了所克隆的xynC基因具有完整的开放阅读框(ORF)，且其核苷酸序列和氨基酸序列与A.nigerCBS 513.88基因组公布的序列一致。其完整ORF大小为696 bp，编码231个氨基酸。

利用MEGA 4.0将XynC与不同来源木聚糖酶的氨基酸序列进行进化树的构建，结果汇总于图1。此进化树反映了不同来源的木聚糖酶之间的遗传距离。其中，黑曲霉来源的3个木聚糖酶均属于糖苷水解酶第11家族(GH11, EC 3.2.1.8)，但它们分属3个不同组合。

图1 进化树描述不同来源的木聚糖酶的遗传距离Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among xylanases from different microorganisms线段的长度表示的是用MEGA 4.0计算的距离；分支节点上的数字代表的是bootstrap百分比。黑曲霉来源的木聚糖酶用粗体标出，木聚糖酶AuXyn11D、AoXynG1、AkXynB、AtXlnA和AuXynA分别来源于A. usamii E001、A. oryzae KBN616、A. kawachii IFO 4308、A. tubingensis和A. usamii。)

进一步利用Clustal X2等软件将上述不同来源木聚糖酶的氨基酸序列进行比对与分析，结果如图2所示。XynC与这些木聚糖酶的氨基酸序列的相似度为42.44%～99.13%。与其他木聚糖酶相比，XynC具有木聚糖酶家族典型的二级结构，且具有其典型的活性中心(Glu117和Glu208)，属于木聚糖酶家族。

(*)保守的氨基酸序列；(:)保守的替换；(.)半保守的替换；虚线表示的是空格；二级结构标在序列的上方；灰色部分标注的是信号肽；活性位点用方框标出；五角星标出的是对酶的最适反应pH有影响的氨基酸残基图2 不同来源的木聚糖酶的氨基酸序列比对Fig.2 Multiple amino aeid sequence alignment of xylanases from different microorganisms

2.2黑曲霉木聚糖酶的分泌表达与初步纯化

将构建获得的重组质粒pPIC-XynC用NcoI线性化后，电转化入毕赤酵母GS115中，并通过G418平板筛选高拷贝转化子，获得重组菌GS115(pPIC-XynC)。在250 mL摇瓶培养120 h后，重组菌的胞外木聚糖酶酶活达到最高，为1.14 U/mL，表达量约为530 mg/L。进一步通过盐析、透析和凝胶过滤层析法，将XynC的粗酶液进行初步纯化，其得率、纯化倍数和比酶活分别为57.9%、9.2倍和19.8 U/mg。蛋白电泳的结果(图3)表明，XynC的纯度已经达到酶学特征分析的要求；其分子质量约为26.0 kDa，略高于其理论分子质量(23.0 kDa)，这可能是因为表达的蛋白经过了糖基化修饰[8]。

M-蛋白分子量标准；1-XynC粗酶液；2-纯化后的XynC图3 SDS-PAGE分析XynC的纯化情况Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of XynC

2.3重组木聚糖酶的酶学特征

2.3.1 重组木聚糖酶的最适反应温度和热稳定性

在不同温度下(25、30、35、40、45、50、60和70 ℃)测定木聚糖酶的酶活，结果如图4-a所示。重组酶XynC的最适反应温度为30 ℃，且在30～45 ℃范围内其相对酶活在80%以上。进一步在上述不同温度下研究XynC的热稳定性，结果表明(图4-b)：(1)在25～40 ℃的水浴中孵育2 h，XynC残留的酶活仍维持在70%以上，具有较好的稳定性；(2)在50 ℃孵育15 min，残留酶活仅有40%左右；(3)在60 ℃和70 ℃孵育15 min，XynC几乎完全失活。

图4 XynC的最适反应温度(a)和热稳定性(b)Fig.4 Optimum temperature (a) and thermostability (b) of XynC

2.3.2 重组木聚糖酶的最适作用pH和pH稳定性

在不同pH反应条件下(pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和5.0)测定XynC的酶活，结果如图5-a所示。由图可知，XynC的最适反应pH为2.5，且在pH 2.0～2.5范围内其相对酶活在80%以上。pH稳定性的研究结果(图5-b)表明，在pH 2.5～4.0的缓冲液中孵育1 h后，XynC仍能保持80%以上的相对酶活；在pH 2.0～7.0孵育1 h后，其残留酶活仍在60%以上，具有较宽泛的pH稳定范围。

图5 XynC的最适反应pH(a)和pH稳定性(b)Fig.5 Optimum pH (a) and pH stability (b) of XynC

2.3.3 金属离子和相关化学试剂对重组木聚糖酶活性的影响

在XynC与其底物进行反应的体系中加入不同的金属离子或化学试剂(终浓度为5 mmol/L)，研究其对XynC酶活的影响，结果汇总于表1。除了K+对XynC的活性有微弱的促进作用外，Ca2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Sn2+和EDTA、SDS等都对XynC的活性有不同程度的抑制作用。其中，5 mmol/L SDS可以使XynC几乎完全失活。

表1 金属离子和化学试剂对重组木聚糖酶酶活的影响

2.4重组酶XynC水解戊聚糖的产物分析

将重组木聚糖酶XynC与50 g/L戊聚糖在pH 2.5和30 ℃反应10 h后，采用薄层层析对其水解产物进行分析，结果如图6所示。戊聚糖经XynC水解后会产生聚合度为3～6左右的低聚木糖。

1-1 mg/mL木糖;2-1 mg/mL低聚木糖;3-XynC与戊聚糖反应上清液;4-灭活XynC与戊聚糖反应上清液；5-戊聚糖；X1～X5-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖图6 薄层色谱分析XynC水解戊聚糖的产物Fig.6 TLC analysis of the hydrolytic products of pentosan catalyzed by XynC

3 讨论

本研究成功将黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在毕赤酵母中进行了克隆与表达。进化树的构建和氨基酸序列比对的结果(图1和图2)表明，重组酶XynC具有木聚糖酶家族典型的二级结构和活性中心，属于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶(GH11，EC 3.2.1.8)。其最适反应pH和温度分别为2.5和30 ℃(图4-a和图5-a)，与许多嗜中温真菌来源木聚糖酶的最适反应pH和温度相似[4, 10, 18]，但低于其他GH11家族木聚糖酶的最适反应pH和温度(比如XynB，其最适反应pH和温度分别为5.0、55 ℃)[19]。此外，室温下将XynC在pH 2.0～7.0的缓冲液中孵育1 h，残留酶活仍在60%以上(图5-b)，如此宽泛的pH稳定范围在其它GH11家族的木聚糖酶中并不常见[6, 20]。在低温和酸性条件下具有良好的稳定性使得XynC可以作为饲料添加剂，在动物酸性的胃肠道中发挥作用。

一些真菌木聚糖酶，比如A.kawachii木聚糖酶XynC[21]和A.niger木聚糖酶XynI[10]都具有较低的最适反应pH和pH稳定性。在这些木聚糖酶中，它们N端的天冬氨酸残基都是保守的。相反地，耐酸性较弱的或中性木聚糖酶中相应位置的氨基酸则是天冬酰胺。在此保守区，XynC中有3个天冬氨酸残基(Asp44、Asp54和Asp57，图2)，因此它具有较低的最适反应pH和良好的耐酸性。其中，Asp57对应于XynI中的Asp37，它会严重影响木聚糖酶的最适反应pH[10]。

Ca2+、Mn2+、Co2+和Cu2+对XynC的酶活有不同程度的抑制作用(表1)，这与它们对XynI酶活的影响类似[8]。据报道，Zn2+可以增强木聚糖酶XynI[8]和XynB[19]的酶活，但它却对XynC具有一定的抑制作用。EDTA是一些木聚糖酶的抑制剂[22]，它可以明显抑制XynC的酶活，这表明XynC是金属酶。但EDTA会促进木聚糖酶XYN186[20]、XYNZG[22]和XynI[8]等的酶活，它们可能不是金属酶，其催化机制也可能与XynC不同。5 mmol/L SDS会强烈抑制XynC的酶活，使它几乎完全失活，该研究结果也得到了MAO等[20]的证实。而5 mmol/L K+对XynC的酶活有微弱的促进作用，与ZHANG等[22]的研究结果一致。

此外，重组酶XynC可以将戊聚糖降解成聚合度为3～6的低聚木糖(图6)。由于低聚木糖不能被哺乳动物的胃肠道吸收，而且可以作为益生元促进肠道益生菌的生长，因此作为饲料添加剂使用可以间接抑制有害菌的生长、改善肠道环境等。此外，低聚木糖还具有防治龋齿、促进微量元素的吸收、降低胆固醇、调节冰点、抗氧化、保水性、改善血清以及调节血压等功能[23]，在食品或饲料行业具有较高的应用潜力。

综上所述，本文成功将黑曲霉CICIM F0510的木聚糖酶基因xynC在毕赤酵母中进行了克隆表达，并对其进行了初步纯化。酶学性质的研究表明，重组酶XynC是一种低温酸性木聚糖酶，且可以将戊聚糖水解成低聚木糖，这为该酶在饲料和食品等行业的应用奠定了良好的基础。

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GenexynCfromAspergillusnigerencodingacold-activeandacidophilicxylanase

JIAO Cong-rui1, YANG Wen-juan1, CHEN Xiao-ling1, DONG Zi-xing2*, JIN Peng2, LIU Xiao-guang2, WANG Zheng-xiang1, 2*

1 (College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China) 2 (College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China)

Xylanase, an enzyme that randomly cleaves internal β-1,4-xylosidic linkages of xylan backbone, has wide applications in feed, food, pulp and paper, and textile industries. In the present study, genexynCencoding xylananse fromAspergillusnigerCICIM F0510 was cloned and expressed inPichiapastoris, and the recombinant strain GS115 (pPIC-xynC) was subsequently constructed. At the shake flask level, the activity of the recombinant enzyme XynC was 1.14 U/mL. The optimum temperature and pH of XynC was determined to be 30 ℃ and 2.5, respectively. This enzyme was also stable at 25-40 ℃ or pH 2.0-5.0. K+slightly enhanced the activity of XynC, whereas Ca2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe3+, Sn2+EDTA and SDS had different inhibitory effects on its activity. Besides, XynC can hydrolyze pentosan to yield short chain xylooligosaccharides with degree of polymerization of 3-6. Such good biochemical properties lay a solid foundation for the applications of XynC in feed and food fields.

cold-active and acidophilic xylanase；Aspergillusniger；molecular cloning；enzymatic properties；xylooligosaccharides

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014869

硕士研究生(董自星博士、王正祥教授为通讯作者,E-mail: dzx@tust.edu.cn; zxwang0519@tust.edu.cn)。

2017-06-02，改回日期：2017-07-25