阿魏酸酯酶对麦汁过滤性能的影响

李晓敏，蔡国林，李兵，尹花，陆健*

1(啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东 青岛，266100) 2(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

阿魏酸酯酶对麦汁过滤性能的影响

李晓敏1,2，蔡国林2，李兵2，尹花1，陆健2*

1(啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东 青岛，266100) 2(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)

研究比较了过滤性能良好的Scope大麦麦芽与存在过滤问题的单二麦芽的水溶性蛋白质组差异，发现参与阿拉伯木聚糖降解的阿拉伯木聚糖呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶存在较大差异，对水溶性阿拉伯木聚糖成分分析发现，单二麦芽中具有较高含量的阿魏酸，推测阿魏酸酯酶缺失是单二麦芽过滤性能缺陷的原因之一，通过添加纯化的阿魏酸酯酶，可有效提高麦汁的过滤速度，降低麦汁浊度和黏度。进一步研究发现，阿魏酸酯酶可有效去除阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸，从而使得其氧化交联减弱，多聚阿拉伯木聚糖含量降低。

麦芽；麦汁；过滤性能；水溶性阿拉伯木聚糖；阿魏酸酯酶

江苏是我国啤酒大麦的重要产区之一，但是由于品种及生产技术等原因，与进口啤酒大麦相比，部分江苏啤酒大麦制成的麦芽，品质不稳定，且存在过滤困难的质量缺陷，严重影响了其在啤酒酿造中的大规模应用。过滤性能是麦芽品质的重要指标，对啤酒生产效率、酵母发酵性能、成品啤酒非生物稳定性等都有重要影响[1]。在糖化过程中，由于大分子物质如淀粉、蛋白质、纤维素、半纤维素等相关水解酶类的缺乏，或其抑制因子的存在，使其不完全降解并相互作用、结合，充斥在麦糟中阻碍过滤，造成麦汁过滤速度慢、过滤性能差[2]。

以前的研究认为β-葡聚糖是影响麦芽过滤性能的主要因素[3-4]，而李胤通过系列研究发现，阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)也是影响大麦麦芽过滤性能的重要的非淀粉多糖，并提出了多聚阿拉伯木聚糖(poly-arabinoxylan, PAX)的概念[5]。周婷等进一步研究发现，水溶性阿拉伯木聚糖(water extractable arabinoxylan, WEAX)侧链上的阿魏酸(ferulic acid，FA)性质比较活跃，由其介导的氧化交联与大麦麦芽过滤性能紧密相关，是AX导致麦芽过滤性能差的重要原因之一[6]。

本项目以过滤性能差异的进口啤酒大麦麦芽Scope和江苏啤酒大麦麦芽单二为研究对象，采用比较蛋白质组学和多糖成分分析等技术，初步确定导致过滤性能差异的降解酶系，通过添加实验验证并研究其初步作用机制，以期为单二大麦乃至其他品种的改良指明方向，为提高江苏啤酒麦芽质量提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

实验用进口啤酒大麦麦芽Scope由青岛啤酒股份有限公司馈赠，江苏啤酒大麦麦芽单二由江苏农垦麦芽有限公司馈赠。RC-DC蛋白定量试剂盒购自Bio-rad公司；Whatman 4号滤纸购自Whatman PLC公司；辣根过氧化物酶POD购自国药集团化学试剂有限公司；愈创木酚购自Sigma公司；牛血清白蛋白、牛血红蛋白、酪氨酸、三氯乙酸等分析纯试剂，均购自上海国药集团化学试剂有限公司；纯化的阿魏酸酯酶，由本实验室前期研究制备[7]。

1.2仪器与设备

双向凝胶电泳系统，GE公司； UV-2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；麦芽标准粉碎机，北京德之杰啤酒技术有限责任公司；自动糖化器，西安轻机所光电公司；WGZ-2-PJ浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；Haake落球式黏度计，Thermo公司。

1.3麦芽比较蛋白质组分析

参照金昭的方法[1]。分别提取Scope及单二麦芽的水溶性蛋白，并通过双向电泳分离，PDQuest图像分析，最后利用质谱鉴定差异蛋白点。

1.4WEAX提取及主要成分分析

参照周婷的方法。分别提取Scope和单二麦芽中的WEAX[6]，采用凱氏定氮法测定蛋白质含量[8]，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[9]，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)分析单糖组成[10]，采用HPLC方法测定其FA[11]。

1.5协定糖化及指标测定

协定糖化工艺和过滤性能的测定主要参照轻工行业标准《啤酒麦芽》[12]。在单二麦芽糖化起始阶段添加不同浓度的BPZ7(0、200、400 U/g麦芽)、POD(0、200、400、600 mg/g麦芽)及二者混合物，糖化结束后，测定麦芽过滤性能及相关指标。

协定糖化麦汁测定的指标主要包括：过滤速度、浊度和黏度，参考轻工行业标准《啤酒麦芽》[12]，过滤速度以起始100 mL回流之后30 min内过滤出的麦汁体积计算；浊度采用EBC浊度仪测定；黏度采用Haake落球式黏度仪测定。

1.6阿魏酸酯酶的酶活测定

参照李兵的方法。以阿魏酸甲酯为底物，配置标准酶反应体系，50 ℃反应10 min后加入冰乙酸终止，并利用高效液相色谱法测定重组阿魏酸酯酶所产生的FA的含量，该反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯生成1 μmol FA所需的阿魏酸酯酶的酶量定义为1个酶活力单位(U)[7]。

2 结果与讨论

2.1基于蛋白质组学分析的水解酶差异

对过滤速度差异明显的Scope和单二麦芽分别提取水溶蛋白，并进行双向电泳，得到双向电泳图谱。经PDQuest 8.0 软件分析，对仅存在于Scope麦芽图谱中的蛋白点，以及其含量高于单二麦芽图谱中的蛋白点进行了胶内酶解、质谱鉴定及数据库检索，发现有14个差异的水解酶类(表1)。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(点1, 2, 3)和阿魏酸酯酶(点17)这两种阿拉伯木聚糖降解酶是两种过滤性能差异明显麦芽的主要差异蛋白。高飞在比较过滤性能差异的Metcalfe和单二麦芽时也发现，阿拉伯呋喃糖苷酶是其中定量差异较显著的水解酶[13]。这些研究表明，单二麦芽过滤速度较慢可能和阿拉伯木聚糖的降解有关。

表1 Scope麦芽中含量高于单二麦芽中的水解酶类

2.2麦芽中WEAX的主要成分分析

将过滤性能差异明显的进口优质啤酒大麦麦芽Scope和单二分别提取 WEAX，对提取的WEAX进行化学成分分析，结果如表2所示。

表2 大麦麦芽中WEAX的主要成分分析

从表2可知，Scope和单二麦芽提取的WEAX中，总糖含量达到91%以上，其中阿拉伯糖和木糖的比例达到了88.0%，仅含有少量的葡萄糖，可能来源于未分离的水溶性β-葡聚糖和糊精。A/X(阿拉伯糖和木糖的比值)是评价AX结构特点的一个重要指标[14]，也是影响WEAX功能的重要因素。由表2可以看出Scope和单二的A/X分别为0.62和0.69，说明单二麦芽的WEAX具有更多的侧链分支。FA是WEAX分子间交联的桥梁，对交联反应起到重要的作用[11]，单二麦芽的WEAX的FA含量也明显高于Scope麦芽的WEAX。结合单二麦芽和Scope麦芽水解酶差异最显著的是阿魏酸酯酶，推测单二麦芽阿魏酸酯酶缺陷导致过滤速度较慢。

2.3麦芽中WEAX对过滤性能的影响

将提取的大麦麦芽WEAX分为两部分进行协定糖化麦汁添加实验，一部分通过添加H2O2/POD体系处理使WEAX氧化交联，另一部分通过阿魏酸酯酶处理后超滤透析去除游离阿魏酸(WEAX-FA)，将两种水溶性阿拉伯木聚糖在麦芽糖化结束后分别添加到麦汁中，分别添加3组(每组添加量为50 mg、100 mg和150 mg)，在麦汁过滤结束后测定麦汁的过滤速度，结果如图1所示。

图1 添加WEAX对过滤速度的影响Fig.1 Effect of added WEAX on filtration rate of wort

由图1可知，随着WEAX添加量的增大，麦汁的过滤速度逐渐减慢，当添加量为150 mg时麦汁的过滤速度降低了30.7%，而添加去除阿魏酸的WEAX，随着添加量的增大，麦汁过滤速度也呈减慢趋势，但过滤速度减慢趋势明显低于WEAX组，在WEAX-FA添加量为150 mg时麦汁过滤速度仅降低约5.7%。前期的研究发现，AX可以通过氧化交联，影响过滤速度，通过对WEAX进行阿魏酸酯酶预处理，可以有效降低其氧化交联产物对过滤速度的影响，表明阿魏酸酯酶可以有效降解WEAX侧链上的FA，从而抑制WEAX的氧化交联。

2.4糖化初始阶段阿魏酸酯酶的添加对大麦麦芽过滤性能的影响

为验证阿魏酸酯酶对麦芽过滤性能、浊度、黏度的影响，将纯化的阿魏酸酯酶按一定量(每50 g麦芽添加阿魏酸酯酶0 U、0.104 U、0.416 U和1.040 U)加入到麦芽糖化的初始阶段，结果如图2所示。由图2可知，当FAE添加量为1.040 U时，麦汁的过滤速度提高了14.5%，黏度降低了6.9%，而麦汁浊度增加了28%。周婷研究认为阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸氧化交联使得麦芽过滤速度降低[6]，图2的结果表明在糖化过程中添加FAE可能抑制水溶性阿拉伯木聚糖的氧化交联，改善麦芽的过滤性能。

图2 FAE对麦汁中麦芽过滤性能的影响Fig.2 Effect of FAE on the filterability of malt

2.5阿魏酸酯酶对过滤速度影响的机制研究

为验证阿魏酸酯酶是否通过水解阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸，阻碍阿拉伯木聚糖的氧化交联，从而提高过滤速度，比较了不同阿魏酸酯酶添加量对麦汁中阿魏酸含量的影响，结果如图3所示。

图3 FAE添加量对麦汁中阿魏酸的影响Fig.3 Effect of FAE addition on the content of FA in wort

从图3可知，随着阿魏酸酯酶添加量的增加，麦汁中阿魏酸含量逐渐增高，当添加量增加到1.04 U时，麦汁中阿魏酸含量基本不再变化，说明阿魏酸酯酶可有效水解大麦麦芽中阿拉伯木聚糖侧链上的结合态阿魏酸，使麦汁中的游离阿魏酸含量比对照提高了近8倍。

阿魏酸酯酶的添加对阿拉伯木聚糖降解的影响结果如表3所示。在协定糖化初期，随着阿魏酸酯酶添加量的增大，麦汁中游离FA的含量逐渐增大，协定麦汁中AX含量逐渐增高而PAX含量逐渐减小，说明阿魏酸酯酶可有效去除AX侧链上的阿魏酸，从而使得AX的氧化交联减弱，AX在阿拉伯木聚糖内切酶的作用下，形成中小分子的AX，从而使得PAX含量降低。周婷的研究发现，麦汁过滤性能和PAX之间呈高度正相关，PAX含量降低，过滤速度提高[6]。

3 结论

本研究以Scope和单二麦芽为研究对象，利用比较蛋白质组学技术发现在Scope麦芽中与含量更高的阿拉伯木聚糖相关的水解酶类，如阿拉伯呋喃糖苷水解酶和阿魏酸酯酶，而单二麦芽水溶性木聚糖中含有较高含量的阿魏酸，说明缺少阿魏酸酯酶可能是单二麦芽过滤性能缺陷的主要原因之一，在单二麦芽糖化阶段添加纯化的重组阿魏酸酯酶，可有效减少去除阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸，减少其氧化交联，从而降低多聚阿拉伯木聚糖的含量，使得麦汁过滤速度大幅提高，麦汁浊度和黏度相应降低。

表3 FAE添加对麦汁中阿拉伯木聚糖降解的影响

[1] 金昭. 江苏啤酒大麦麦芽过滤性能缺陷的研究—基于蛋白质组学的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2014.

[2] 李华. 酿造酒工艺学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2011: 184-258.

[3] 夏振江, 郭忠森. β-葡聚糖对啤酒生产的影响及在制麦过程中的控制[J]. 酿酒, 2004, 31(5): 93.

[4] VIS R B, LORENZ K. Malting and brewing with a high β-glucan barley [J]. LWT-Food Science and Technology, 1998, 31(1): 20-26.

[5] LU Jian, LI Yin. Effects of arabinoxylan solubilization on wort viscosity and filtration when mashing with grist containing wheat and wheat malt [J]. Food Chemistry, 2006, 98(1): 164-170.

[6] 周婷. 阿拉伯木聚糖的氧化交联对江苏啤酒大麦麦芽过滤性能影响的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2015.

[7] 李兵, 蔡国林, 朱德伟.等. 黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 微生物学通报, 2017(5): 1 065-1 073.

[8] Malt: Analytica-EBC [S]. European Brewery Convention. Nürnberg: Fachverlag Hans Carl. 2006.

[9] 李丹. 苯酚-硫酸法测定食品总糖方法的应用和改进[J]. 中国卫生检验杂志, 2003, 13(4): 506.

[10] KRAHL M, MULLER S, ZARNKOW M, et al. Arabinoxylan and fructan in the malting and brewing process [J]. Quality Assurance and Safety of Crops amp; Foods, 2009, 1: 246-255.

[11] DERVILLY-PINEL G, RIMSTEN L, SAULNIER L, et al. Water-extractable arabinoxylan from pearled flours of wheat, barley, rye and triticale. Evidence for the presence of ferulic acid dimers and their involvement in gel formation [J]. Journal of Cereal Science, 2001, 34(2): 207-214.

[12] QB/T 1686-2008. 啤酒麦芽[S]. 北京: 中国轻工业出版社, 2008.

[13] 高飞, 金昭, 蔡国林.等. 阿拉伯呋喃糖苷水解酶对啤酒大麦麦芽过滤性能的影响[J]. 食品工业科技, 2014, 35(14): 237-240；255.

[14] IZYDORCZYK M S, BILIADERIS C G. Cereal arabinoxylans: advances in structure and physiochemical properties [J]. Carbohydrate Polymers, 1995, 28(1): 33-48.

Theinfluenceofferuloylesteraseonfilterabilityofwort

LI Xiao-min1,2, CAI Guo-lin2, LI Bing2, YIN Hua2, LU Jian2*

1(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer, Qingdao 266100, China) 2(National Engineering Laboratory of Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Filterability is one of the most important quality traits of malt. It is of great practical significance to resolve the problem of filterability defects of Chinese malt. The present study compared that proteomes of Scope and Dan’er malts that with distinct filterability. It was found that arabinoxylan arabinofuranohydrolase and feruloyl esterase involved in the degradation of arabinoxylan were the most different enzymes. In addition, the components analysis of WEAX from Scope and Dan’er malt revealed that WEAX from Dan’er malt contained more ferulic acid. Therefore, we proposed that lack or short of feruloyl esterase in Dan’er malt contributed majorly to its filterability defect. By adding purified recombinant feruloyl esterase in the mashing process using Dan’er malt, the filtration rate of wort was significantly raised, accompanied by the decreased turbidity and viscosity of wort. The feruloyl esterase could remove the ferulic acid in the chain of arabinoxylan effectively and therefore inhibit the formation of ferulic acid dipolymer, which led to decreased content of poly-arabinoxylan.

malt; wort; filterability; WEAX; feruloyl esterase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014971

副教授(陆健教授为通讯作者)。

国家863计划(2013AA102109)；啤酒生物发酵工程国家重点实验室开放基金资助课题(K2014001)；青岛创业创新领军人才计划项目(13-cx-15)

2017-06-24，改回日期：2017-07-37