止颤汤参与帕金森病大鼠自噬途径中P62调节α-突触核蛋白的研究

黄宁静，Wei Jianning，李文涛

止颤汤参与帕金森病大鼠自噬途径中P62调节α-突触核蛋白的研究

黄宁静，Wei Jianning，李文涛

目的观察止颤汤调节帕金森病(PD)大鼠自噬途径中P62与α-突触核蛋白(α-Syn)表达的研究。方法采用lactacystin注射于大鼠脑部黑质造成PD模型，实验设立对照组、PD模型组、中药组，并采用Western blot及PCR法观察3组大鼠P62与α-Syn的表达情况。结果免疫印迹显示，P62及α-Syn在对照组、模型组、中药组的含量为(0.27±0.03，0.23±0.03；0.73±0.07，0.51±0.02；0.38±0.16，0.37±0.03)，模型组较对照组明显升高(Plt;0.01)，中药组与对照组相比基本接近(Pgt;0.05)。与模型组相比有统计学意义(Plt;0.01)；PCR结果提示，P62及α-Syn在3组的含量为(0.45±0.05，0.17±0.07；8.93±1.68，10.81±1.9；2.66±0.96，1.65±0.76)，模型组的含量较对照组明显上升(Plt;0.01)，中药组与模型组相比数值下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论止颤汤可以调节自噬途径中的P62蛋白，降低α-Syn的表达，可能是止颤汤治疗帕金森病的机制。

帕金森病；止颤汤；自噬；P62；α-突触核蛋白；大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的慢性神经系统退行性病变之一[1]，美国有100万人口患有此种疾病，而且以每年新增5万多新病例的速度增加，据统计，65岁以上人群中，帕金森病有1%发病率，随着人口老龄化，帕金森病病人越来越多。目前在治疗上，左旋多巴替代疗法在缓解PD病人症状上有一定疗效，但同时也会出现一些严重的毒副作用，且不能有效阻止病情的发展。而外科手术有创伤，代价昂贵，适应对象受限，不是一种理想方法。神经移植治疗或基因治疗PD目前都只是处于临床前研究阶段。因此，PD已成为神经领域研究热点。

研究显示，PD的中枢神经系统中可以见到α-突触核蛋白(α-Synuclein)[2]的异常聚集，这是由于承担清除异常蛋白的自噬途径没有正常发挥代谢α-Syn的功能。自噬目前被认为是参与了PD发病。调节自噬可能是治疗PD的一个有效方法。而P62参与体内自噬蛋白降解过程，前期研究中也提示，当药物阻断自噬途径时，通过不同方式均检测到P62的表达有所增加，已有文献报道，P62的缺失增加了α-Syn这个病理特征[3]。开发调节自噬，针对α-Syn及其相关靶点的药物，可能是控制PD进程的有效途径。本研究试图运用中药止颤汤治疗PD大鼠，观察大鼠大脑黑质中P62与α-Syn的含量变化，从而进一步验证P62与α-Syn的关联，探讨中医药从自噬途径对PD的调节作用。

1 材料与方法

1．1 药物组成及制备 止颤汤为上海市中医医院名老中医李如奎教授经验方，剂量：黄芪15 g，丹参9 g，钩藤18 g，知母12 g，白芍12 g，制大黄15 g，升麻9 g。加水煎煮2次，第1次加6倍量水，煎煮1 h；第2次加4倍量水，煎煮45 min，煎液分别滤过，合并浓缩至生药1.28 g/mL，搅匀，分装即得。

1．2 实验动物 成年雄性SD大鼠18只，体质量180 g～220 g。

1.3 帕金森病大鼠模型制备 将18只大鼠随机分为实验组(12只)与对照组(6只)。实验组所有动物均经反复行为测试后，确认其无旋转行为后进行实验。腹腔注射2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，颅平位固定于脑立体定位仪上。大鼠头部局部常规消毒后，剪开头皮，剥离骨膜，参照包新民等[4]所著大鼠脑立体定位图谱确定左侧黑质致密部(SNC)和黑质纹状体通路(VTA)两坐标：①SNC前囟后5．0 mm，矢状缝左侧1．7 mm，颅骨表面下7．6 mm。②VTA前囟后4．6 mm，矢状缝左侧0．9 mm，颅骨表面下7．5 mm；并根据大鼠体重和头颅大小在规定范围内确定具体坐标，并用三棱针进行标记，用牙科钻小心钻透颅骨，按确定坐标将微量注射器缓慢进入预定深度。实验组向每点注射lactacystin 8 μg(4 μL)，对照组则注射等体积生理盐水，深度以针孔斜面中点为参照点，以颅骨下硬脑膜处为零点，以1 μL/min的速度缓慢旋转推药，注射完毕后留针10 min，缓慢退针，术后常规缝合伤口，连续腹腔注射青霉素104U/(kg·d )，持续1周以防感染，局部伤口每日碘酒消毒1次，7 d后拆线。

1.4 模型成功评价标准 术后1 周起，每隔7 d于09：00时进行行为学检测，阿扑吗啡(APO)0．5 mg/kg腹腔注射。在直径为40 C1TI的塑料盆中观察大鼠的旋转行为。记录注射后5 min大鼠的旋转次数，同时观察其行为学变化，连续测试3周。若连续观察30 min，大鼠恒定向右侧旋转，平均转速gt;7 r/min，视为成功PD模型大鼠；若小于7 r/min的右转鼠或左转鼠、不转鼠均被淘汰。

1.5 分组与给药 将造模成功的12只实验组PD模型大鼠采用随机数字法，筛选出模型组和中药组各6只，其余6只脑内注射生理盐水未出现旋转行为的大鼠作为对照组。中药组用止颤汤灌胃，PD大鼠每公斤体重给药量按成年人(60 kg)每公斤体重剂量的10倍计算，溶于生理盐水中，1．2 mL/100 g灌胃，给药时间为09：00～10：00，每日1次。每周称体重一次，按体重调整给药量，连续给药4 周。模型组和对照组每日按体重给予等量生理盐水灌胃。

1.6 观察指标

1.6.1 Western Blot检测细胞内P62及α-Synuclein蛋白表达 断头处死动物，迅速取脑并在冰盒上分离纹状体区，将其分装于液氮中冻存。将液氮中的脑组织样本取去融化，胞浆裂解液提取组织胞浆蛋白，测蛋白浓度后分装置于-70℃保存上样前加入5×SDS加样缓冲液煮沸10 min，20 g蛋白质样品用10%SDS-PAGE分离后，350 mA恒流湿法电转移1 h至硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。

P62的检测：用第一抗体在4 ℃温育过夜。以下抗体：抗兔LC3B(1∶500)，抗小鼠β-actin(1∶1000)，抗兔P62 / SQSTM1，抗小鼠ubiquitin。充分洗涤后，在室温用二抗孵育1 h，所用的二抗是的抗兔(1∶5 000)和抗小鼠(1∶10 000)进行检测。

α-Synuclein的检测：滴加抗α-synuclein(1∶500)，抗ubiquitin(1∶500)过夜，TBS洗膜3次，滴加Cy3标记(发红光)的抗小鼠二抗稀释液(1∶500)室温孵育1 h，洗膜3次，滴加免疫印迹发光试剂(ECL试剂)于NC膜上，室温反应5 min。在暗室内曝光，冲洗胶片。

1.6.2 RT-PCR检测细胞内P62及α-Synuclein mRNA表达 将组织样本排放在管架，室温待解冻，依次将各组组织(剪取米粒大小)转移至12×55 mm去核酶试管中，依次每一管中加入1 mL Trizol(预冷)。电动匀浆器(转速10 000 r/min)处理(30～45) s。每标本间处理后用酒精(75%乙醇的配置∶1倍的DEPC处理水加3倍的无水乙醇)棉球擦拭，DEPC处理水清洗。各管中加入氯仿200 μL，激烈振荡15 s，4℃，12 000 r/min，离心10 min 。小心吸出水层加入依次编号的Eppendorf管中，再加入二倍体积的异丙醇(约600 μL)，混匀，置于-20℃冰箱，30 min，4 ℃，10 000 r/min，离心10 min。弃上清留沉淀。用650 μL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃，8 000 r/min，离心5 min，弃上清留沉淀。重复步骤一遍，充分吸尽残留液，打开管盖，干式恒温器65℃，(5～10)min，烘干，20 μL DEPC处理水，溶解RNA，-20℃冰箱，保存，待用。并进行逆转录及PCR。

2 结 果

2.1 两组Western blot比较 对照组P62的含量为0.27±0.03，模型组的含量为0.73±0.07，数值较对照组明显升高(Plt;0.01)，中药组为0.38±0.16，与对照组相比基本接近，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。与模型组相比有统计学意义(Plt;0.01)；对照组α-syn含量为0.23±0.03，模型组的含量为0.51±0.02，数值比对照组明显上升(Plt;0.01)，中药组为0.37±0.03，与对照组相比基本接近(Pgt;0.05)。与模型组相比有统计学意义(Plt;0.01)。详见图1。

注：n为对照组；中为中药组；M为模型组。

2.2 两组PCR检测 对照组P62的含量为0.45±0.05，模型组的含量为8.93±1.68，较对照组明显上升(Plt;0.01)，而中药组为2.66±0.96，与模型组相比数值下降(Plt;0.05)。对照组α-syn的含量为0.17±0.07，模型组的含量为10.81±1.9，较对照组有统计学意义(Plt;0.01)，而中药组为1.65±0.76，与模型组相比数值下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)。

3 讨 论

帕金森病是威胁老年社会人类健康的重大疾病。目前药物及手术、基因治疗都不是非常理想的选择，由于其发病率增加及其不可根治性等特点，PD已成为神经领域研究热点。

有研究表明，PD等神经退行性疾病都是以异常蛋白质在中枢神经系统大量积聚为特征。帕金森病具有蛋白聚集体在胞内沉积、路易小体及路易神经突的特点，α-Synuclein(α-突触核蛋白)[2]是组成它们的主要成分。有报道显示，过度表达、异常修饰或者突变α-Syn能损伤黑质，也有很多研究证明了突变的α-Synuclein如没有被及时清除，导致在细胞内聚集，形成寡聚体，就会发生PD[5-6]。黑质致密部神经细胞体内的α-Synuclein异常聚集是PD的病理形态学标志。

众多研究表明，α-Synuclein蛋白溶酶体途径降解主要通过自噬途径中的巨自噬方式[7-10]。自噬是细胞内过多或异常的细胞器及其周围的蛋白质和部分细胞质被双层膜所包裹形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合并且降解其所包裹的内容物[11-12]。在哺乳动物细胞中，蛋白质的降解信号都是泛素化。为了使目标蛋白发生自噬性降解，P62作为泛素化修饰的靶蛋白能够结合到自噬受体上[13]，并可以与自噬体膜蛋白LC3相互作用，从而能够把泛素化的蛋白质运送到自噬体内降解，而它本身也通过自噬系统代谢[14]。目前文献报道，自噬积极参与了PD的发病[15]，前期的神经变性疾病研究中也提示[16]，P62与自噬途径关系密切，一旦自噬系统阻断，P62含量就会提高。因此开发调节自噬，针对α-Synuclein及其相关靶点的药物，可能是控制PD进程的有效途径。

可以说自噬是一个机体净化机制，通过降解胞质内受损的结构，来改善微环境，维持细胞的动态平衡。这与从中医角度，在机体脏腑功能失调下内生邪热痰浊瘀血之实邪的自我清除，以维持内环境的阴阳平衡的机制是相一致的。而中医药历来重视整体调理，中药组方配伍灵活，对疾病可兼顾局部和整体，多途径、多靶点地进行综合干预。本次研究通过中药干预自噬途径中的P62，加强α-Syn的代谢，从而治疗PD。中医药治疗帕金森病大鼠，观察大鼠的α-synuclein的表达，但是对于自噬系统中的P62蛋白并未涉及[17]。

本实验采用的止颤汤是名老中医李如奎教授的经方，多年运用于临床上颇有疗效[18]，也有多项课题提示对PD大鼠的脑内细胞微环境有所改善[19]。故此次用止颤汤治疗帕金森病大鼠，观察对照组、造模组及中药组的P62与α-Syn，免疫印迹显示，P62及α-syn在3组含量为0.27±0.03，0.23±0.03；0.73±0.07，0.51±0.02；0.38±0.16，0.37±0.03，模型组较对照组明显升高(Plt;0.01)，而运用止颤汤的中药组为与对照组相比基本接近(Pgt;0.05)。而与模型组相比有统计学意义(Plt;0.01)；同样，PCR结果提示，P62及α-syn在3组的含量为(0.45±0.05，0.17±0.07；8.93±1.68，10.81±1.9；2.66±0.96，1.65±0.76)，模型组的含量为较对照组明显上升(Plt;0.01)，中药组为与模型组相比数值下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)。PCR与免疫印迹结果类似，P62与α-Syn在PD模型组的含量较对照组显著升高，有统计学意义(Plt;0.01)。α-Syn作为帕金森病的异常蛋白将会被检测到异常的聚集。而同样在自噬途径中扮演重要角色的P62也在造模成功后数值上升，这可能也与PD的自噬途径受损后P62的聚集有关。在运用止颤汤后，两者中药组的含量较模型组下降，甚至接近于对照组，提示止颤汤有增强自噬功能，调节P62蛋白，从而清除α-Syn。

但自噬途径中，止颤汤是否完全通过P62对α-Syn进行调节的作用机制尚未完全明确，需要进行更进一步的探讨研究，这将对中医药治疗帕金森病带来更确切的治疗依据。

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2016-10-14)

(本文编辑 王雅洁)

The Observation of Zhichan Decoction on P62 Adjusting α-Synuclein in Autophagy of Parkinsonian Rats

Huang Ningjing， Wei Jianning， Li Wentao

Shanghai Hosipital of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200071， China

Li Wentao

ObjectiveTo study the effects of Zhichan decoction (ZCD) on P62 adjusting α-synuclein in autophagy of Parkinsonian rats.MethodsThe rat mode1 of Parkinson disease (PD) was induced by lactacystin injection in substantia nigra of brain. Twelve lactacystin-lesioned rats were modeled successfully and randomly divided into 2 groups： model group treated with saline， and ZCD group treated with ZCD，respectively. Other 6 rats with sham-operation were served as controls．Rats were sacrificed，and western blotting techniques polymerase chain reaction (PCR) techniques were used to measure the expression of P62 and α-synuclein in striatum.ResultsWestern blotting showed that the P62 and α-synuclein were 0.27±0.03，0.23±0.03 in control group， 0.73±0.07，0.51±0.02 in model group， 0.38±0.16，0.37±0.03 in ZCD group，respectively.The expressions of P62 and α-synuclein increased in model group， which were higher than that in control group and ZCD group (Plt;0.01). PCR results showed the P62 and α-synuclein were 0.45±0.05，0.17±0.07 in model group， 8.93±1.68，10.81±1.9 in model group， 2.66±0.96，1.65±0.76 in ZCD group，respectively. The P62 and α-synuclein increased in model group， which were higher than that in control group (Plt;0.01).Compared with model group， the P62 and α-synuclein decreased in ZCD group (Plt;0.05).ConclusionZCD can adjust the P62 protein to reduce α-synuclein，which maybe the mechanism of ZCD on PD.

Parkinson’s disease；Zhichan decoction；autophagy；P62；α-synuclein；rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.008

1672-1349(2017)21-2689-04

上海市卫生局科教处青年项目(No.20134Y164)

上海市中医医院(上海 200071)

李文涛，E-mail：1132@szy.sh.cn

信息：黄宁静，Wei Jianning，李文涛.止颤汤参与帕金森病大鼠自噬途径中P62调节α-突触核蛋白的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(21)：2689-2692.