创伤性脑损伤后海马区S1PR1表达与NSCs增殖的关系

叶玉勤 杨永祥 苏鑫洪 何军 陈晓燕 贺晓生

(1第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032; 2解放军第163医院神经外科，湖南 长沙 410000)

·神经损伤研究·

创伤性脑损伤后海马区S1PR1表达与NSCs增殖的关系

叶玉勤1, 2*杨永祥1苏鑫洪1何军1陈晓燕1贺晓生1*

(1第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032;2解放军第163医院神经外科，湖南 长沙 410000)

目的探讨创伤性脑损伤(TBI)后大鼠海马区1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)的表达变化特点及其与神经干细胞(NSCs)增殖的关系。方法96只健康雄性SD大鼠随机分为TBI后1、3、7、14、21、28 d组(n=10)和各时点相应的对照组(n=6)。采用控制性皮层损伤法建立大鼠TBI模型，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和性别决定相关基因簇2(Sox2)免疫荧光染色双标NSCs，观察TBI后海马区NSCs的增殖趋势，Western Blot检测和分析海马区S1PR1的表达变化规律。结果与对照组相比，伤后第1天海马区NSCs数量增多，第7天达到高峰，第14、21、28天逐渐减少(Plt;0.05)。海马区S1PR1于伤后第1天表达显著上调，高峰出现在伤后第7天，于第14、21、28天表达逐渐下调(Plt;0.05)。结论TBI后海马区S1PR1表达变化与NSCs增殖趋势在时程上一致，S1PR1可能在TBI后神经再生与修复过程中具有重要调控作用。

创伤性脑损伤; 1-磷酸鞘氨醇受体1; 神经干细胞; 海马

创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是以高致残率和致死率居于各类创伤之首，不仅可直接造成原发性脑组织损伤，还引发一系列继发性病理生理改变导致级联损伤效应,导致TBI的预后往往不理想。促进神经再生与功能修复是改善TBI预后的关键所在。近年来的研究表明，成年哺乳动物的室管膜下区(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回颗粒细胞层下区(subgranular zones, SGZ)存在大量内源性神经干细胞(neural stem cells, NSCs)。虽然TBI在一定程度上可激活这些处于静息状态的NSCs，参与神经再生和功能修复。但脑损伤后NSCs自身的增殖能力有限，无法满足修复损伤的实际需要[1-3]。因此，寻找能够提高TBI后体内NSCs增殖能力的突破点，是促进脑损伤后神经再生与修复亟待解决的问题。

磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)是具有生物活性的鞘脂代谢产物，通过与特异性的G蛋白受体偶联，广泛参与调控多种生物功能[4]。目前已发现的S1P受体家族有5个成员，分别是1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine-1-phosphate receptor 1, S1PR1)、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5。其中，S1PR1和S1PR2在NSCs中呈特性高表达，两者在体外培养的NSCs自我更新和迁移过程中具有重要调控作用[5-6]。新近的研究发现，S1PR1在海马区广泛表达，在神经系统发育的过程中，参与调控神经发生和新生血管生成等多种生物学过程[7]。然而，TBI后海马区S1PR1的表达是否会发生变化，其改变有何特点，S1PR1的表达变化与海马区NSCs的增殖潜能有无潜在联系，目前尚不明确。本研究通过建立TBI动物模型，检测TBI后不同时点海马区NSCs的增殖水平和S1PR1的表达变化特征，探讨两者之间的可能关系，为TBI后神经再生与修复研究提供新思路。

材料与方法

一、主要实验试剂

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BrdU)(B9285)购自美国Sigma公司；山羊抗BrdU多克隆抗体(GTX21893)和兔抗大鼠性别决定相关基因簇2 (sex determining region Y-box 2, Sox2)多克隆抗体(GTX101507)，均购自美国GeneTex公司；Alexa fluoro-488标记的驴抗山羊抗体(A-11015)和Alexa fluoro-594标记的驴抗兔抗体(A-11016)，均购自美国Invitrogene公司；兔抗大鼠S1PR1多克隆抗体(4809)购自美国Prosci公司；抗β-actin兔多克隆抗体(CW0097)购自北京康为世纪公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(7074)购自美国CST公司；蛋白定量试剂盒(P00 11)购自碧云天生物技术研究所。

二、实验动物与分组

96只健康雄性SD大鼠(250～300 g)由第四军医大学实验动物中心提供，对所有大鼠进行随机编号，然后通过随机数字表抽取数字，按照对应的动物编号进行如下随机分组。首先随机分为对照组(n=36)和TBI组(n=60)。各组再均分为6个亚组，分别再 TBI后第1、3、7、14、21、28天处死，各亚组随机选取半数(对照亚组n=3，TBI亚组n=5)做免疫荧光染色，观察TBI后海马区NSCs增殖变化情况。另一半用于Western Blot定量检测，分析TBI后海马区S1PR1的表达情况。

三、动物TBI模型制备

根据控制性皮层损伤方法，应用PinpointTMPCI 3000脑损伤仪器制备大鼠TBI模型。室温条件下，2%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，无菌条件下切开头皮，暴露右顶骨，于颅骨矢状缝中点旁2 mm处，牙科钻开直径为3 mm圆形骨窗，暴露硬脑膜。设置致伤参数：打击深度1.2 mm，打击速度3.0 m/s和接触时间100 ms，致伤后复位骨片，缝合头皮。TBI组大鼠出现弓背、毛发竖立、呼吸浅慢和意识障碍，在致伤1 h后内清醒，清醒后左侧肢体瘫痪，向左侧绕圈行走。对照组仅切开头皮，暴露右侧顶骨，不予打击致伤。

四、脑组织取材

对做免疫荧光染色的动物，各时间点处死前1 d腹腔注射BrdU，剂量按照50 mg/kg，共3次注射，间隔8 h。处死时先以2%戊巴比妥钠麻醉，而后4%多聚甲醛灌注固定，整脑取出后在4%多聚甲醛液中(4 ℃)浸泡过夜。在前囟后3.3～4.5 mm之间冠状切取整脑组织块，常规脱水、透明、石蜡包埋和连续冠状切片。对做Western Blot检测的大鼠，同上法麻醉后立即断头处死，取整脑，冰上迅速剥离海马组织，-80 ℃保存备用。

五、免疫荧光染色

采用二步免疫荧光双标染色法，取相应组别的脑组织切片，经二甲苯梯度脱蜡和乙醇梯度水化，3%过氧化氢去离子水封闭10 min。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗片3遍，枸橼酸缓冲液(pH=6.0)高温高压抗原修复5 min，室温下自然冷却。PBS洗片3遍，滴加BrdU(11∶200)和Sox2(11∶500)一抗，4 ℃过夜。PBS洗片3遍，滴加Alexa fluoro-488(1∶2000)和Alexa fluoro-594(11∶1000)二抗，室温孵育2 h，PBS洗片3遍，甘油封片。取5张连续切片，荧光显微镜下高倍(400×)观察海马齿状回，每张切片取5个非重复视野，拍照后采用IPP 6.0图像分析软件定量分析平均吸光度值，获得每张切片BrdU/Sox2阳性细胞数，计算5张切片BrdU/Sox2阳性细胞数的均值，表示单只动物的海马区NSCs增殖水平。

六、Western Blot 检测

取相应组别的大鼠海马组织，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，充分研磨，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，二辛可宁酸法蛋白定量，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，结束后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，置于40 mL含5%脱脂奶粉的等渗缓冲溶液中，室温封闭1 h，与S1PR1(11∶500)与β-actin(11∶2000)抗体4 ℃孵育过夜，洗片10 min×3次，再与辣根过氧化物酶标记的二抗(11∶10 000)室温孵育1 h，洗片10 min×3次，增强型化学发光试剂显色，暗室曝光，显影，定影。以β-actin作为内参照，用Gel-Pro Analyzer 4图像分析系统测定条带的灰度值，以S1PR1与β-actin的灰度值之比表示S1PR1蛋白的相对表达水平。

七、统计学分析

结 果

一、TBI后海马区NSCs的增殖趋势

在海马齿状回颗粒层下区，胞核内绿色荧光代表BrdU阳性，胞核内红色荧光代表Sox2阳性，红绿叠加为黄色荧光，代表BrdU/Sox2双标阳性。NSCs呈胞核内BrdU/Sox2双标阳性染色(图1)。与对照组相比，各TBI时点组的海马区NSCs增殖水平显著增强。于TBI后第1天，BrdU/Sox2双标阳性细胞数量开始增多，7 d达到高峰，14、21、28 d逐渐减少，但仍高于对照组(Plt;0.05，表1)。

图1 对照组和TBI后7 d组海马区BrdU/Sox2免疫荧光染色 (×400)
Fig 1 The representative images of hippocampal BrdU/Sox2 immunofluorescence staining in control group and post-traumatic 7 d group (×400).

A～C: BrdU, Sox2 and BrdU/Sox2 staining of hippocampus in control group; D～E: More BrdU, Sox2 and BrdU/Sox2 positive cells in hippocampus were observed at 7 d after TBI.

Groupn1d3d7d14d21d28d TBI552．34±5．25a75．59±8．45a122．76±3．38ab101．27±6．13a87．23±4．90a64．15±3．44a Control323．38±4．4120．71±6．0324．23±3．9523．06±5．6422．95±6．8721．64±4．25

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsother time-point TBI groups.

Groupn1d3d7d14d21d28d TBI51．10±0．17a1．36±0．16a1．99±0．19ab1．61±0．13a1．17±0．15a0．95±0．15a Control30．64±0．080．67±0．050．61±0．100．62±0．070．65±0．110．67±0．09

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsother time-point TBI groups.

二、TBI后海马区S1PR1蛋白表达水平

TBI后海马区S1PR1蛋白的表达明显上调，伤后1 d表达量开始增加，随着损伤时间的延长，高峰出现在TBI后第7天，伤后14、21、28 d表达呈恢复性下调，但仍高于对照组(Plt;0.05，图2、表2)。

图2 Western Blot检测海马区S1PR1蛋白的表达
Fig 2 The expression of S1PR1 protein in hippocampus was detected by Western Blot

讨 论

近年来，虽然脑损伤后神经再生与修复研究取得了长足的进步，多种影响TBI后神经再生与脑功能修复的因素得以揭示。但是，由于TBI后脑内复杂多变的病理生理反应，参与神经再生和修复的调控网络极为复杂，目前的研究仍面临巨大挑战。应用干细胞修复组织损伤作为一种新兴的途径，被寄予厚望，尤其在脑损伤后神经修复中，NSCs的研究方兴未艾。NSCs是作为一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，具有修复神经损伤的巨大潜能。NSCs移植是通过向神经系统引入外源性细胞，替代丧失或损伤的神经元，以达到修复神经损伤的目的。但移植入体内的NSCs增殖程度与分化方向难以控制，其安全性、稳定性和伦理性等诸多问题不容忽视[8-9]。

近年来，激活内源性NSCs修复自身的神经损伤日益受到重视，相关的研究也取得了一定进展[10-11]。研究表明，在生理状态下，位于SVZ和SGZ的内源性NSCs多处于静息状态，而在脑缺血、脑外伤等病理状态下，内源性NSCs可被激活，参与神经再生和修复。但由于内源性NSCs的激活、增殖、分化与迁徙受TBI后脑内多种作用因素的影响，其增殖和向神经元定向分化的能力不能满足修复损伤的需要[12-13]。因此，研究影响内源性NSCs增殖和分化的因素，明确相关作用分子和作用途径，通过合理的干预措施，提高内源性NSCs的增殖能力，促进TBI后神经修复，是目前神经科学的研究热点问题。

本研究在建立动物TBI模型的基础上，观察到伤后1 d海马区NSCs开始增多，7 d达到高峰，并持续到伤后28 d仍维持在较高的增殖水平，表明海马区被激活的NSCs具有参与TBI后神经再生和修复的巨大潜能。我们的这一结果与其他文献报道基本一致，证实了内源性NSCs的增殖高峰期在伤后7 d左右，这可能是干预NSCs增殖能力的最佳时间窗[2,18]。此外，另有学者报道，随着NSCs的增殖、分化和向损伤区迁移，脑损伤造成的学习和记忆障碍也得到不同程度的改善[3,19]。

在S1PRs家族中，S1PR1是中枢神经系统表达最多、活性最强的受体亚型，主要分布于大脑皮质、小脑和边缘系统等部位[7,14-15]。研究表明，S1PR1广泛参与调控神经元细胞凋亡、兴奋性谷氨酸传递和线粒体功能等多种生物学效应[15-16]。新近的研究发现，当NSCs内特异性高表达的S1PR1被质粒干扰下调时,可导致移植入体内的NSCs向脊髓损伤区域迁移的数量显著减少[6]。此外，Harada等研究表明，在胚胎神经发生的过程中，S1P对NSCs的增殖和形态变化具有重要调控作用，采用放射线自显影技术对胎脑进行显像，发现介导S1P发挥调控作用的受体，很可能是与G蛋白Gi亚单位结合的S1PR1[17]。在本研究中，通过Western-Blot检测，我们发现成年大鼠的海马组织也富含S1PR1,并在TBI后表达明显上调，伤后第7天为表达高峰，到伤后28 d仍处于高表达状态。有意义的是，S1PR1的这一变化规律与NSCs的增殖趋势在时程上一致，提示S1PR1可能再TBI后NSCs的增殖过程中具有重要调控作用。

综上所述，本研究分别从形态学和蛋白水平，在建立动物TBI模型的基础上，首次探讨了TBI后海马区S1PR1的表达变化规律，发现其时程变化特征与脑损伤后NSCs的增殖趋势一致，为深入研究TBI后S1PR1在神经再生与修复中的作用提供了初步的实验依据。合理干预S1PR1的表达可能有助于促进TBI后神经再生与修复，但其潜在作用机制仍有待进一步研究。

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Theassociationbetweenhippocampalsphingosine-1-phosphatereceptor1expressionandneuralstemcellsproliferationfollowingtraumaticbraininjury

YEYuqin1,2,YANGYongxiang1,SUXinhong1,HEJun1,CHENXiaoyan1,HEXiaosheng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;2DepartmentofNeurosurgery, 163rdHospitalofPLA,Changsha410000, China

ObjectiveThe potential association between hippocampal sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) expression and neural stem cells (NSCs) proliferation in a rat model of traumatic brain injury (TBI) was studied.MethodsNinety-six rats were randomly divided into TBI 1 d group, 3 d group, 7 d group, 14 d group, 21 d group, 28 d group (10 in each), and six control groups (6 in each). TBI model was induced by a controlled cortical injury device. NSCs were double-labeled by thymidine analog 5-Bromo-2-deoxyUridine (BrdU) and sex determining region Y-box 2 (Sox2) with immunofluorescence staining. The level of S1PR1 protein in hippocampus was detected by Western Blot at scheduled time-points after TBI.ResultsNSCs in hippocampus was activated at 1 d after TBI, reached the peak at 7 d, was followed by a decrease from 7 d to 28 d when maintained a higher level compared to control group (Plt;0.05). Hippocampal S1PR1 protein was increased from 1 d post trauma, and peaked around 7 d, decreased at 14 d, 21 d, and 28 d to a lower level but still higher than that of control group (Plt;0.05).ConclusionThe S1PR1 expression varies in a similar temporal pattern with NSCs proliferation in hippocampus, indicating that S1PR1 may be required for the neurogenesis after TBI.

Traumatic brain injury; Sphingosine-1-phosphate receptor 1; Neural stem cells; Hippocampus

1671-2897(2017)16-110-05

R 651.1

A

国家自然科学基金资助项目(81171155)

叶玉勤，博士研究生，主治医师，E-mail: chinayeyuqin@163.com

*通讯作者： 贺晓生，教授、主任医师，博士生导师，E-mail: hexiaos@fmmu.edu.cn; 叶玉勤，博士研究生，主治医师，E-mail: chinayeyuqin@163.com

2016-10-01；

2016-11-27)