菌株H8絮凝剂的分离与提纯

石 磊（齐齐哈尔市环境监测中心站 黑龙江 齐齐哈尔 161005）

菌株H8絮凝剂的分离与提纯

石 磊（齐齐哈尔市环境监测中心站 黑龙江 齐齐哈尔 161005）

通过絮凝分布实验，确定了絮凝物的有效分布，主要分布在发酵液的上清和沉淀中，采用超声波法对沉淀进行破碎提取絮凝剂，并获得其最佳条件为F=40，T=10，R=4000。分别对上清液和沉淀中的絮凝剂采用乙醇沉淀法进行絮凝干物质的提取，每升发酵液可获得0.562g絮凝剂。

低温产絮菌；絮凝剂纯化

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的有絮凝成分的代谢产物，以多糖、蛋白质为主，还含有脂类、纤维素、DNA等物质。它是利用生物技术得到的具有微生物分解性和安全性的新型、无毒、易降解、不产生二次污染的絮凝剂。微生物絮凝剂在废水处理中应用范围很广，它可以应用于城市生活污水、建材和焦化废水、畜产废水、食品工业废水、塑料工业废水、电镀废水等处理中，并且微生物絮凝剂在染料废水的脱色处理中效果非常好。1976年，J.Nakamura等对能产生絮凝效果的微生物就进行了研究，目前该方面也受到国内研究者的重视。本实验对筛选出来的菌株H8絮凝剂进行了分离、提纯研究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

实验室分离出来的H8菌种。

1.2 试验仪器

（1）755B紫外可光分光光度计（上海精密仪器科学有限公司）；

（2）双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；

（3）HH.Ⅱ420-S电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；

（4）阪神立式冷藏陈立柜（江苏雪龙电器有限公司）；

（5）SPX-250B型生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）；

（6）MLS-3020灭菌锅（日本三洋）；

（7）Mettler AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；

（9）恒温磁力搅拌器（上海精科实业有限公司）。

1.3 产絮菌H8絮凝活性分布试验

将筛选出的产絮菌H8连续传代3次后，制成菌悬液，按最佳优化培养条件进行培养，发酵液以5000rmp离心10min，分别取上清液、沉淀和发酵液测定它们对高岭土悬浊液的絮凝活性。

1.4 不同离心转速对絮凝活性的影响

将 发 酵 液 在 2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000rpm下分别离心10min，测定不同转速下收集的上清与沉淀对高岭土絮凝活性的影响。选取最佳离心的转速。

1.5 发酵液离心后沉淀中絮凝物质的获取

本试验用两种方法进行沉淀中絮凝物质的获取，分别为超声波震荡法和机械震荡法，并对两种方法进行了优化试验。

（1）超声波法处理沉淀获取絮凝物质的方法

将离心后得到的沉淀称重，用蒸馏水50倍稀释，混匀后置于超声波振荡器中超声破碎，之后离心测定上清液的絮凝性。本试验分别对超声频率和超声时间进行了优化，获得了最佳的处理条件。

（2）振荡法破碎沉淀获取絮凝物质的方法

将离发酵液获得沉淀称重，之后用蒸馏水50倍稀释，混匀后用漩涡振荡器震荡分别测定不同时间下获得的上清液的絮凝率。

1.6 产絮菌H8絮凝剂的分离提纯方法

采用有机溶剂沉淀法对微生物絮凝剂进行提纯，将离心后发酵液的上清及沉淀经超声波破碎后的上清中加入2倍体积在4℃预冷好的无水乙醇，于4℃放置24h，在离心机中8000rpm离心10min，将沉淀重溶于蒸馏水中，重复前面的步骤一次，将获得的絮凝剂放在真空干燥箱中于室温干燥，得到絮凝剂。

2 结果与讨论

2.1 产絮菌H8絮凝活性分布试验结果

将产絮菌H8发酵液以5000rmp离心10min，分别测定上清液和沉淀菌体的絮凝活性。试验结果如图1所示，结果表明上清和沉淀的絮凝效果都在90%以上，因此要分别对上清和沉淀进行絮凝剂的提取。

图1 产絮菌H8絮凝分布试验结果

2.2 不同离心转速对菌液絮凝性的影响

将发酵液在不同转速下离心，得到的沉淀50倍稀释，混匀后与上清一起分别测定他们对高岭土的絮凝性，结果见图2，由图2可以看出，上清液对高岭土的絮凝性随着转速的升高而下降，在4000rpm时絮凝性最好。沉淀在4000-6000rpm时与上清液的絮凝性相当，高于6000rpm时沉淀的絮凝性增加，说明有效的絮凝物质在胞内外都存在。沉淀的最佳絮凝为8000rpm。

2.3 菌体离心沉淀中絮凝物质的提取结果

2.3.1 振荡法提取絮凝物质

用漩涡振荡器破碎沉淀，测定不同振荡时间下获得的上清对高岭土的絮凝性，结果如图3所示，由图3可以看出在震荡10min时絮凝效果较好，但是与超声波破碎相比还略差一点，并且用振荡器处理费力不易操作，因此以后均采用超声波处理。

2.3.2 超声波破碎法提取絮凝物质

（1）超声波频率的优化结果

将离心得到的沉淀50倍稀释后在不同的超声频率下超声波处理，8000rpm离心测定上清液的絮凝性，结果如图4所示，由图4可以看出在超声波频率为40、80、100HZ时，得到的上清对高岭土的絮凝性较好。

图2 不同转速对菌液的絮凝性影响

图3 不同振荡时间对絮凝率的影响

图4 超声波频率对沉淀提取的优化

（2）超声时间的优化结果

在最佳超声频率下，分别测定不同时间下各个频率的上清的絮凝情况，结果如图5所示，由图5可以看出频 率 在 40HZ，80HZ，100HZ时分 别 超 声10min，15min，10min时得到上清液的絮凝性最好。

（3）超声波处理后菌悬液离心转速的优化结果

将三种超声波最佳超声时间下获得的菌悬液在不同转速下离心，优化最好的离心条件，结果如图6所示，结果表明F=40，T=10′，R=4000rpm；F=80，T=15′，R=4000rpm；F=100，T=10′，R=6000rpm时絮凝效果较好。

图5 不同超声时间下测得的絮凝率

图6 不同转速下用超声波获得的沉淀的絮凝性

图7 用超声波法优化沉淀中絮凝物质的最佳提取条件

2.4 沉淀中絮凝物质获取的最佳条件

将三种频率下的获得的上清在同一条件下测定絮凝率，结果如图7所示，由图7可以看出F=40和F=100时沉淀破碎后得到的上清对高岭土的絮凝性较好，但是考虑到成本耗损情况，选择F=40，T=10，R=4000的条件进行沉淀中絮凝物质的提取。

2.5 有机溶剂法分离微生物絮凝剂

采用无水乙醇沉淀法，每升发酵液上清可获得0.402g絮凝剂。沉淀通过超声处理后上清获得絮凝剂量为0.4g/L。所提取的絮凝剂都是略带微黄的白色粉末，溶于水，将絮凝剂制成浓度20g/L的溶液。所提取的絮凝剂对高岭土的絮凝情况见图8，由图8可以看出，上清中提取的絮凝剂比沉淀中提取的絮凝剂对高岭土的絮凝颗粒要大一些，并且20mg的絮凝剂就可以对50ml的0.4%的高岭土悬浊液产生很好的凝效果。文献中每升高岭土要加入700mg絮凝剂才能产生较好的絮凝效果，与此相比本絮凝剂有低剂量高絮凝的特点。

图8 絮凝剂对高岭土的絮凝情况

3 小结

（1）通过絮凝分布试验，确定了有效的絮凝物主要分布在发酵液的上清和沉淀中，

（2）用超声波破碎法和振荡破碎法对沉淀中的絮凝物质进行破碎提取，结果表明超声波破碎法较好，采用超声波法对沉淀进行破碎提取絮凝剂。

（3）对超声波破碎法进行优化，确定了在沉淀中获取絮凝物质的最佳条件为F=40，T=10，R=4000。

（4）分别对上清液和沉淀中的絮凝剂采用乙醇沉淀法进行絮凝剂的提取，产量为0.562g/L，每升高岭土溶液中加入400mg絮凝剂，就能产生很好的絮凝效果，絮凝率达98%以上。

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Isolation and Purification of Strain H8 Flocculant

ShiLei（Environment Monitoring Center Station of Qiqihaer City Qiqihaer HeiLongjiang 161005）

We determined effective distribution of flocs through flocculation experiment.Flocs were mainly distributed in the supernatant and sedimentation of fermentation liquid.We used ultrasonic method to crush sedimentation and extract flocculant and obtained the optimum condition for F=40，T=10，R=4000.We used ethanol precipitation method to extract flocculation dry matter from flocculant in supernatant and sedimentation.Each liter of fermentation liquid could get 0.562 grams of flocculant.

Low temperature floc bacteria Flocculant Purification

X172

A

1674-263X（2017）03-0065-05

2017-09-20

石磊（1982-），男，本科，高级工程师，从事环境监测工作。