人乳铁蛋白的沙漠小球藻表达系统的构建与鉴定

牟云+汪文伦+许万云+胡梦薇+王丹+严国+王会敏+高剑峰

摘要：为获得人乳铁蛋白的沙漠小球藻（Chlorella sp. GTD8A1）的表达系统和稳定的小球藻GTD8A1-hLF工程藻种，将人乳铁蛋白基因导入小球藻细胞中进行表达鉴定。以人血cDNA为模板，RT-PCR扩增得到人乳铁蛋白基因（GenBank登录号NM-002343.4），经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后，连接到植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中，获得重组质粒载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，将重组质粒电击转入GTD8A1中，通过菌落PCR鉴定后扩大培养，在DNA和RNA水平分析人乳铁蛋白基因的整合和转录，SDS-PAGE和Western Blot分析获得70 ku的目的蛋白；将转基因藻种（GTD8A1-hLF）在BBM培养基中进行培养周期优化。结果表明，重组人乳铁蛋白在沙漠小球藻细胞中表达成功；通过Elisa测其人乳铁蛋白表达量在20 d时达到最大，浓度为13.28 mg/L。

关键词：小球藻；人乳铁蛋白；表达系统；SDS-PAGE；Western Blot；构建；鉴定

中图分类号： S188 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0138-05

收稿日期：2016-05-06

基金项目：国家自然科学基金（编号：31460276）。

作者简介：牟 云（1992—），女，四川华蓥人，硕士研究生，从事可再生能源的开发与利用相关研究。E-mail：1171534413@qq.com。

通信作者：高剑峰，教授。E-mail：jianfengg@shzu.edu.cn。 新疆古尔班通古特沙漠位于准噶尔盆地的中央，是我国第二大沙漠和面积最大的固定、半固定沙漠。年降水量70～150 mm，冬季有积雪，春季和初夏降水略多，冬季最低地表温度可达-25 ℃，夏季最高地表温度可达30 ℃[1]。生长在此的小球藻及其他藻类与高等植物经过百万年的进化，已经完全适应了沙漠的极端环境。从20世纪80年代末开始，对沙漠微藻的研究与开发受到国内外研究者的重视[2]。研究表明，在新疆沙漠中生长着百余种藻类，小球藻是其中重要的组成部分[3]。小球藻为球形或椭圆形绿色单细胞藻类植物，也是真核微生物的一种。其细胞直径3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，遗传相对保守，其广泛分布于土壤、湖泊、海洋、南北极生态系统和荒漠，是生物量丰富、生产力较高的单细胞生物[4]。作为广泛分布的单细胞藻类植物，小球藻是在单细胞水平上研究和建立转基因表达系统及其相关条件优化和其他具有药用价值的副产品开发和研究的绝佳材料。目前，由于四代生物燃料崛起，国内外关于小球藻基因组学、基因工程[5]的研究与开发日趋活跃。近几年，随着小球藻基因组测序[6]的完成，以及对其外源蛋白基因排斥与免疫[7-8]的深入研究，使得小球藻这种单细胞微生物成为最佳生物反应器的研究焦点，也是研究外源基因表达的最佳材料。

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，是一种糖基化蛋白，分子量为70～80 ku、约700个氨基酸，基因的大小在2 112～2 530 bp之间；广泛分布在初乳、牛奶及其相应的分泌物如眼泪、唾液中，是一种多功能性糖蛋白，在各种动物之间的同源性较高[9]。它能螯合生物体液中的铁（Fe2+或Fe3+）或者破坏微生物的细胞膜，使其减少微生物（细菌、病毒和寄生虫）的增殖、黏附或者将其杀死，从而表现出抗菌的作用[10]。人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）是一条多肽链折叠形成2个对称的环状结构（N and C lobes），包含部分α-螺旋鏈接域[11]。人乳铁蛋白对免疫、细菌、病毒、微生物、抗寄生虫和真菌都有相应的保护和抗性的作用，从而被开发成食品添加剂和保健品等。同时，科学界也将乳铁蛋白列为新型抗生素的候选者[12]。目前，人乳铁蛋白也被加工成婴幼儿奶粉的食品添加剂，受到广大消费者的青睐。但是，人乳铁蛋白主要由初乳和血液来提取获得，这就使得人乳铁蛋白的产量少之又少，价格昂贵。因此，有科学家提出采用分子的手段去开发不同种类的乳铁蛋白的重组体，以增加乳铁蛋白开发和利用价值。

本试验结合小球藻的优势和人乳铁蛋白的优点，首次以真核为宿主，在沙漠小球藻GTD8A1基因组上整合外源人乳铁蛋白基因（hLF），利用小球藻细胞作为生物反应器及其生长周期短、传代快速、代谢可控的优点，获得稳定表达人乳铁蛋白小球藻菌株，进而为小球藻生产人乳铁蛋白下游工业提供优良的藻种。这将为人乳铁蛋白的下游工业、商业化和推广使用提供试验基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 小球藻GTD8A1由笔者所在实验室分离、纯化和鉴定得到。小球藻GTD8A1所用BBM培养基[13]：NaNO3 250.00 mg/L，KH2PO4 175.00 mg/L，K2HPO4 75.00 mg/L，MgSO4·7H2O 75.00 mg/L，CaCl2·2H2O 25.00 mg/L，NaCl 25.00 mg/L，EDTA 50.00 mg/L，KOH 31.00 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μl/L。

1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α菌株为笔者所在实验室保存；植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS，由石河子大学生命科学学院黄先忠老师馈赠。endprint

1.1.3 引物设计及合成 从NCBI上获取人乳铁蛋白的基因序列（NM-002343.4），通过Primer 5软件设计引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 藻种培养及其条件 取对数生长末期的小球藻培养液，按10%的接种量接入装有100 mL BBM培养基的250 mL锥形瓶中，置于光照培养箱中静止培养，培养条件为：光照度100 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，培养温度（23.0±05 ℃）。

1.2.2 人全血RNA的提取和人乳铁蛋白基因的克隆 采用Trizol试剂提取人血总RNA，试验步骤按说明书进行。总RNA产物用1%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min）检测。以提取的RNA为对象，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，EU）说明书合成cDNA第一链。再以此cDNA为模板，以hLF-F2/hLF-R2为特异性引物，对人乳铁蛋白基因进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性60 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸 2.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。对PCR产物进行切胶回收，得到人乳铁蛋白基因，将目的基因连接到T4（TaKaRa，China）载体中，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素（30 mg/L）平板培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定。最后将鉴定的阳性克隆送深圳华大基因科技有限公司测序，对测序结果进行blast比对。

1.2.3 构建重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS 将目的基因hLF的回收产物和载体pCAMBIA2300-35S-OCS用KpnⅠ和XbaⅠ分别双酶切4 h，其过程和反应体系按TaKaRa的说明书进行。将hLF酶切产物与载体酶切产物在连接酶的作用下16 ℃连接过夜，其过程和反应体系也按TaKaRa的说明书进行。通过热激法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。然后将感受态细胞涂布于含有卡那霉素（30.0 mg/L）平板培养基上，挑取白斑菌落作为模板，以hLF-F1/ hLF-R1为引物进行菌落PCR鉴定，采用质粒小提试剂盒所述步骤提取重组载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，并用KpnⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证。

1.2.4 表达载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS转化小球藻情况的检测 利用电转化方法[14]将构建好的表达载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS导入小球藻GTD8A1中，将电击后的小球藻细胞涂于含30 mg/L卡那霉素的BBM培养基上，挑取平板上长出的单藻落，放在10 μL的ddH2O中，95 ℃ 变性后作为模板，以hLF-F1/hLF-R1为引物进行PCR验证。阳性转基因藻种GTD8A1-hLF转入到含有 50 mg/L 卡那霉素的BBM培养基中培养，用于后续试验。

1.2.5 SDS-PAGE和Western Blot分析 小球藻蛋白的提取采用植物蛋白提取试剂盒（TIANGEN，China），具体操作步骤见说明书。Western Blot 过程参照Lin等的试验方法[15]。

1.2.6 培养周期的优化 在含有50 mg/L卡那霉素的BBM培养基中，分别于处理后0、4、8、12、16、20、24、28 d测定其总蛋白含量（g/L）和人乳铁蛋白含量（mg/L）。其中，总蛋白含量（g/L）按考马斯亮蓝说明书进行，人乳铁蛋白含量（mg/L）按Elisa试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 人全血RNA提取和人乳鐵蛋白基因的克隆

通过Trizol法提取人全血的RNA后，采用反转录试剂盒和PCR克隆得到2 133 bp的人乳铁蛋白基因，经测序分析证实，人乳铁蛋白基因序列与GenBank（登录号NM-002343.4）公开的人乳铁蛋白基因全长序列99%相同，说明目的基因克隆成功，其中电泳检出了200 bp的条带可能是由于引物添加过多而引起的引物二聚体造成的试验现象，这对目的基因回收不产生影响，可以进行后续试验，其结果见图1。

2.2 植物表达载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS构建和验证

本试验采用双酶切和DNA酶连接的试验方法构建表达载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，表达载体构建过程见图2。构建好的载体通过热激的方法导入到大肠杆菌DH5α细胞中，然后进行蓝白斑筛选，试验结果见图3。由图3可知，挑选白斑菌落扩大培养后，提取质粒载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，将提取好重组质粒载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS送深圳华大基因科技有限公司测序分析证实，人乳铁蛋白基因也整合到重组质粒当中。同时对重组质粒载体PCR和双酶切检测，得到2 133 bp的目的条带。

2.3 DNA和RNA分析

将菌落PCR检测为阳性小球藻菌落，经过含有抗性BMM液体培养基扩大培养后。采用植物DNA提取试剂盒和Trizol分别提取DNA和RNA，以hLF-F1/hLF-R1为引物进行分子水平上分析，通过PRC和RT-PCR分析得到5、6、8、10号小球藻含有2 133 bp的目的条带，通过结果表明，人乳铁蛋白基因也能整合到小球藻细胞中，并且得到转录，结果与预期一致（图4）。

2.4 SDS-PAGE和Western Blot分析

将DNA和RNA分子水平上鉴定的5、6、8、10藻种再一次在含有抗性的BBM液体培养基中扩大培养后，采用植物总蛋白提取试剂盒提取转基因藻的总蛋白，通过SDS-PAGE和Western Blot检测得到70 ku的目的蛋白条带。其中，图 5-A 中条带 5 为 5 号藻蛋白SDS-PAGE试验结果；条带6endprint

为6号藻蛋白SDS-PAGE试验结果；条带8为8号藻蛋白SDS-PAGE试验结果；条带10为10号藻蛋白SDS-PAGE试验结果；11号为空白对照SDS-PAGE试验结果。图5-B中序号与图5-A一致，只是图5-B是Western Blot的试验结果。

2.5 培养周期的优化

将藻种（GTD8A1-hLF）在不同的培养时间下，测定人乳铁蛋白的人乳铁蛋白含量和总蛋白含量，进行3次测量试验结果的平均值。由图6可知，最佳的培养周期为20 d，其人乳铁蛋白含量和总蛋白含量分别为 13.28 mg/L、12.73 g/L。其中，通过RT-PCR预测人乳铁蛋白的表达结果与用Elisa测定的试验结果一致，获得的最适培养周期将作为以下试验的培养周期。

3 讨论

试验在宿主小球藻GTD8A1的基因组上插入外源hLF基因对其进行基因改造并成功表达，建立了人乳铁蛋白的沙漠小球藻的表达系统，并通过相关的手段进行鉴定。从人血中获取RNA克隆出cDNA到人乳铁蛋白的表达，其相关的试验结果都得到验证（图1～图6）。图1-B中出现200 bp左右的条带，这与所需要的目的条带2 133 bp条带不在同一位置上，造成这样的原因可能是引物二聚体的出现，但这不会对后续试验造成影响；图5-A中获得了70 ku目标条带和杂带，同时在11号空载样的位置上没有看见目标条带的出现，但是通过Western Blot试验后在图5-B中11号空载样的位置也没有出现目标条带，结果表明，人乳铁蛋白的沙漠小球藻的表达系统构建成功。

人乳铁蛋白的最初生产主要来自于初乳的分离和纯化，其产量小不利于规模化生产，这就须要探索一种技术来解决其所存在的问题。藻类早期研究主要利用其自身细胞合成产物，如β-胡萝卜素、二十二碳六烯酸（DHA）和虾青素等[16-17]，来开发具有商业和药用价值的生物产品，随后也有研究者利用藻类（如螺旋藻、小球藻和栅藻）生物反应器来生产一些蛋白保健食品[18]。例如，Koo等成功构建牛乳铁蛋白的小球藻表达系统并且表达成功，使得藻类为转基因宿主以及构建人乳铁蛋白的表达系统提供可能，利用带CaMv35s启动子的表达载体pCAMBIA1304成功构建牛乳铁蛋白的小球藻表达系统并且表达成功，获得目标基因序列部分长为 1.1 kb，通过SDS-PAGE和Western Blot技术检测到35 ku的蛋白条带[14]，尽管笔者没有获得牛乳铁蛋白的全长，但是其研究使得藻类成为转基因宿主以及在其细胞中构建人乳铁蛋白的表达系统可能。然而，本研究通过带CaMv35s启动子的表达载体pCAMBIA2300的植物表达载体，成功构建了人乳铁蛋白基因全长的沙漠小球藻表达系统，获得转基因藻种GTD8A1-hLF，并通过PCR手段检测到人乳铁蛋白基因全长为2 133 bp，以及通过SDS-PAGE和Western Blot技术检测到70 ku的蛋白条带，这将为小球藻生产人乳铁蛋白全长提供了可能。

然而，国内对人乳铁蛋白转基因的研究主要集中在酵母、水稻和动物（牛）等真菌和高等动物中，Jiang等在毕赤酵母细胞中成功表达了人乳铁蛋白，其蛋白浓度高达1 200 mg/L，但是蛋白活性不高，促使人们进一步的开发其他表达系统[19]；吴景欢在水稻种成功表达重组人乳铁蛋白，其蛋白含量为05%[20]；文胜通过基因工程的手段获得转人乳铁蛋白的牛初乳，并且构建了相应的表达体系，其蛋白浓度在2.5～3.5 mg/L 之间[21]。国外对乳铁蛋白转基因研究主要集中在马铃薯和动物（小鼠）等高等植物和动物中，Chong等在马铃薯中成功的构建和表达了人乳铁蛋白，其蛋白表达浓度为可溶性蛋白总浓度的0.1%[22]；Choi等在马铃薯中成功建立了人乳铁蛋白的表达载体，其蛋白表达浓度为可溶性蛋白总浓度的3%[23]；Hwang等在小鼠中构建完成人乳铁蛋白的表达体系[24]。通过对国内外转基因人乳铁蛋白研究发现，在沙漠小球藻进行人乳铁蛋白的表达还鲜有研究，本研究获得的表达系统表达的人乳铁蛋白的含量在13.28 mg/L，与前人的研究有相似之处，但是该表达系统还有待进一步进行产物优化研究。

本试验通過目的基因的克隆、载体的构建、转化、分子水平分析以及SDS-PAGE和Western Blot验证，最终获得了能成功表达人乳铁蛋白的植物表达载体，同时上游重组蛋白的表达系统也构建完成，可以为下游提供必要的技术基础和早期的藻种。虽然，人乳铁蛋白能在小球藻中表达，但是想要将此技术运用到下游工业中还有一定的困难，原因在于：第一，本试验只是获得能表达人乳铁蛋白的沙漠小球藻，所有的试验都是在实验室的条件下进行的，若是想要运用到下游工业生产当中，还须要进一步对其产物条件进行优化研究和摸索，影响规模发酵的诸多条件如重组小球藻在反应器当中的最适温度、pH值、光照条件和培养基等。第二，想要重组人乳铁蛋白的小球藻能够生产安全、稳定的人乳铁蛋白，那么分离和提取工艺还须要进一步地探索。如何在分离提取的过程中不产生对人体有毒害物质，而且又不损失应用价值和功能，是重组人乳铁蛋白作为功能性食品和食品添加剂的重要条件之一。第三，后期处理的成本也是发展的关键问题。相信随着对微藻研究和认识的进一步深入，以及下游工业的分离和提取技术的发展，这些问题都将在短时间内得以解决，未来运用微藻生产人乳铁蛋的应用前景将不可限量。

4 结论

本试验通过RNA和DNA的提取，采用PCR、RT-PCR、测序以及SDS-PAGE和Western Blot等技术手段，成功地在沙漠小球藻中建立了人乳铁蛋白的表达系统，获得了能够表达人乳铁蛋白的重组表达载体pCANBIA2300-35S-hLF-OCS，其人乳铁蛋白的表达浓度为13.28 mg/L。

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