养猪微生物发酵床芽胞杆菌空间分布多样性

刘国红,刘 波,王阶平,朱育菁,车建美,陈倩倩,陈 峥

福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福州 350003

养猪微生物发酵床芽胞杆菌空间分布多样性

刘国红,刘 波*,王阶平,朱育菁,车建美,陈倩倩,陈 峥

福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福州 350003

了解微生物发酵床大栏养猪垫料中的芽胞杆菌多样性和空间分布规律,为微生物发酵床管理、芽胞杆菌新资源挖掘及菌剂开发奠定基础。将发酵床划分为32个方格(4行 × 8列),采用五点取样法获得每个方格的样品。采用可培养法从32份样品中分离芽胞杆菌菌株,利用16S rRNA基因序列初步鉴定所分离获得的芽胞杆菌种类。利用聚集度指标和回归分析法,分析芽胞杆菌的样方空间分布型。通过Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数、Hill指数及丰富度指数分析,揭示微生物发酵床中芽胞杆菌的空间分布多样性。从32份样品中共获得芽胞杆菌452株,16S rRNA基因鉴定结果表明它们分别隶属于芽胞杆菌纲的2个科、8个属、48个种。其中,种类最多的为芽胞杆菌属(Bacillus),30种；赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus),6种；类芽胞杆菌属(Paenibacillus),5种；短芽胞杆菌属(Brevibacillus),3种；鸟氨酸芽胞杆菌属(Ornithinibacillus)、大洋芽胞杆菌属(Oceanibacillus)、少盐芽胞杆菌属(Paucisalibacillus)和纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)各1个种。芽胞杆菌种类在发酵床空间分布差异很大,根据其空间出现频次,可分为广分布种类,如地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)；寡分布种类,如根际芽胞杆菌(B.rhizosphaerae)；少分布种类,如弯曲芽胞杆菌(B.flexus)。依据其数量,可分为高含量组优势种群,如地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)；中含量组常见种群,耐盐赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillushalotolerans)；寡含量组寡见种群,如根际芽胞杆菌(B.rhizosphaerae)；低含量组偶见种群,如土地芽胞杆菌(B.humi)。空间分布型聚集度和回归分析测定表明,芽胞杆菌在微生物发酵床的分布类型为聚集分布。微生物发酵床垫料中芽胞杆菌种类总含量高达4.41×108个/g,其种类含量范围为0.01—94.1×106个/g(均值为8.96×106个/g),丰富度指数(D)、优势度指数(λ)、Shannon-Wiener指数(H′)和均匀度指数(J′)分别为0.4928、0.2634、1.3589和0.9803,其中香农指数最大的单个芽胞杆菌种类为地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)。根据芽胞杆菌种类多样性指数聚类分析,当欧式距离λ=17时,可分为高丰富度高含量和低丰富度低含量类型。微生物发酵床的芽胞杆菌种类丰富、数量高,是一个天然的菌剂“发酵罐”,有望直接作为微生物菌剂,应用于土壤改良、作物病害防控、污染治理等领域。

芽胞杆菌；微生物发酵床；16S rRNA 基因；空间分布；多样性

生猪养殖过程造成严重的环境污染,以福建省为例,2011年生猪存栏1297.80万头,按每天每头猪排放粪尿加冲洗猪栏污水约25 kg计算,全年排污量高达11842.425万t,成为农业面源污染的主要污染源之一[1]。近年来,微生物发酵床应用于养猪,采用垫料(椰糠、谷壳、菌糠、锯末等配合)铺垫猪舍,接入微生物菌剂,猪粪尿直排其上,通过微生物原位发酵,分解猪粪、消除臭味,从而实现生猪养殖的零排放,解决养猪污染的问题[2- 4]。

微生物发酵床养猪思路最早可以追溯到中国360年前张履祥辑补《沈氏农书》记载的猪圈垫草饲养方法[5]。现代微生物发酵床养殖研究最早见于日本,1970年日本建立了第一个以木屑为垫料的发酵床[6],中国香港的Tiquia等研究了发教床垫料翻堆的作用[7],德国的Kaufmann等研究了育肥猪发酵床猪粪营养平衡[8]。加拿大Biotech公司于1985年推出一个以秸秆为垫料的发酵床系统[9],克罗地亚的Margeta等分析了本国养猪发酵床优缺点及其发展前景[10],波兰的Knecht等研究发现发酵床猪舍猪寄生虫病流行低于漏缝地板猪舍[11],刘波等设计了2100m2的大栏发酵床智能化养猪系统的猪舍[12]。

关于发酵床微生物特性研究报道较少,刘波等研究了发酵床微生物群落脂肪酸生物标记多样性[13]。郑雪芳等分析了发酵床垫料微生物亚群落的分化[14]。张学峰等揭示了不同深度发酵床垫料土著稳定微生物菌群[15]。王迪分离鉴定了发酵床的芽胞杆菌(Bacillus)[16]。林莉莉等研究了发酵床猪舍环境与猪体表微生物分布状况[17]。张庆宁从微生物发酵床筛选出了分解猪粪的芽胞杆菌[18]。刘让等筛选芽胞杆菌作为发酵床发酵菌种[19]。

微生物发酵床对猪病具有一定的生防作用,郑雪芳等研究发现微生物发酵床养猪基质垫层形成的稳定微生物群落结构能抑制大肠杆菌特别是致病性大肠杆菌的生长[20]。毕小艳研究了猪用发酵床垫料中微生物动态变化及对猪免疫力的影响[21]。以往的研究表明,芽胞杆菌作为发酵床的优势菌群,具有生长优势强,耐发酵高热,能够产生多种与猪粪降解相关的酶类[18],具有降解猪粪[16]、抑制病原[22]、清除臭味[23]等的作用；随着在发酵床饲养时间的延长,从对应猪分离的大肠杆菌的抗药性逐渐降低[18]。

研究发酵床芽胞杆菌特性,了解发酵床芽胞杆菌空间分布多样性,对于研究发酵床微生物群落功能、猪粪降解机理、猪病生防机理等具有重要意义。目前,关于微生物发酵床芽胞杆菌种类结构,数量分布,空间格局等的研究未见报道。本研究以2100 m2的微生物发酵床大栏养猪为研究对象,通过空间格局采样,用可培养法分离芽胞杆菌方法,对发酵床芽胞杆菌种类分布、数量分布、空间分布的多样性进行分析,利用空间分布型、多样性指数评估养猪微生物发酵床中芽胞杆菌的空间分布特征,为发酵床管理、猪粪资源化利用、猪病的生防等提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

2015年1月26日,从福建省农业科学院福清现代设施农业样本工程示范基地大栏养猪微生物发酵床采集样品,发酵床垫料已使用1a至1.5a左右。该大栏发酵床猪场建筑面积为2100 m2(35 m × 60 m),发酵床槽面积1910 m2,除两个隔离栏,养殖面积为1600 m2,发酵床深度80 cm,发酵床垫料由70%椰糠和30%谷壳组成。发酵床饲养1600头育肥猪,饲养密度为1头/m2(图1)。

图1 大栏微生物发酵床Fig.1 The piggery bedding

采样方法：将大栏发酵床宽度方向划分4栏(行),长度方向划分8栏(列),每个栏采用五点取样方法采集0—20 cm的样品并混合获得栏的垫料样品,共采集32个空间的32个样品(图2),装入无菌聚氯乙烯塑料瓶,带回实验室,并立即进行芽胞杆菌菌株的分离与保存。

1.2 仪器与试剂

PCR仪和凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)；恒温培养箱(BI- 250AG)购自施都凯仪器设备(上海)有限公司；2×PCR Master Mix购自上海铂尚生物技术有限公司；引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化钠5.0 g,pH 7.2—7.4,琼脂15.0 g,水1.0 L。

1.3 微生物发酵床芽胞杆菌分离与鉴定

通过梯度稀释涂布法分离获得微生物发酵床样品中的芽胞杆菌,根据菌落形态特征等进行芽胞杆菌种类归类、统计计数及纯化,采用-80 ℃甘油冷冻法进行保存。采用Tris-饱和酚法提取芽胞杆菌基因组DNA。采用通用细菌16S rRNA引物进行扩增、测序,主要参考Liu等描述的方法[24]。16S rRNA基因扩增引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)。检测出有条带的菌株PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。将测序所得16S rRNA序列在韩国网站(EZtaxon-e.ezbiocloud.net)上进行序列比对分析[25],初步判断得出芽胞杆菌种的分类地位。根据Tindall等描述,当16S rRNA相似性>97%时可定义为同一个分类单元[26]。

图2 发酵床空间采集格局Fig.2 Samples information collected from fermentation bed in the piggrey

1.4 微生物发酵床样方芽胞杆菌种类与数量空间分布

微生物发酵床划分成横向4个单元,纵向8个单元,共取样32个空间样本。统计各空间样本芽胞杆菌种类数、数量总和、最大值、最小值、平均值等,比较发酵床空间样本芽胞杆菌种类与数量的变化,绘制直方图分析芽胞杆菌种类在微生物发酵床空间样本中出现频次和数量。

1.5 微生物发酵床芽胞杆菌空间分布型

基于微生物发酵床4行8列采集方案,构建数据矩阵,统计每行样本芽胞杆菌平均值和方差,利用聚集度指标和回归分析法,分析芽胞杆菌样方空间分布型(表1)。

表1 微生物发酵床芽胞杆菌空间分布型指数

1.6 微生物发酵床芽胞杆菌多样性指数

以芽胞杆菌种类为样本,以样本为指标,构建数据矩阵,利用生物统计软件PRIMER v5(Primer-E Ltd.,Plymouth,United Kingdom [2001])进行计算、统计微生物发酵床芽胞杆菌种类出现频次、种类数量、丰富度指数(D)、均匀度指数(J′)、优势度指数(λ)、Shannon-Wiener指数(H′)和Hill指数(N1)。

以芽胞杆菌为样本,以多样性指数为指标,构建数据矩阵,通过生物统计软件SPSS 16.0,以欧氏距离为尺度,用类平均法进行微生物发酵床芽胞杆菌多样性指数聚类分析。多样性指数公式如下：

1)丰富度指数(D)

D=(S-1)/lg (N)

2)均匀度指数(J′)

J′=H′/lg (S)

3)优势度指数(λ)

4)Shannon-Wiener指数(H′)

H′=∑Pi×lgPi)

5)Hill指数(N1)

N1=exp (H′)

式中,Pi=Ni/N。Ni为第i种芽胞杆菌的数量,S为芽胞杆菌占据的单元总数,N为芽胞杆菌种类个体总数。

2 结果与分析

2.1 微生物发酵床芽胞杆菌的分离与鉴定

实验结果见表2。根据菌落形态特征区分,从32份微生物发酵床空间样品中分离获得了芽胞杆菌452株,通过16S rRNA基因序列比对分析,所有芽胞杆菌菌株相似性皆大于97.0%,鉴定为48个种,隶属于芽胞杆菌纲的2个科即芽胞杆菌科(Bacillaceae)和类芽胞杆菌科(Paenibacillaceae),8个属即芽胞杆菌属(Bacillus)(30种)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)(5种)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)(6种)、短芽胞杆菌属(Brevibacillus)(3种)、鸟氨酸芽胞杆菌属(Ornithinibacillus)(1种)、大洋芽胞杆菌属(Oceanibacillus)(1种)、少盐芽胞杆菌属(Paucisalibacillus)(1种)和纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)(1种)。

表2 微生物发酵床芽胞杆菌种类分离与鉴定

FJAT是FuJian Agaricultural Technology(福建农业科技)的缩写

2.2 微生物发酵床样本芽胞杆菌空间分布

2.2.1 微生物发酵床空间样本芽胞杆菌种类分布

实验结果见表3。微生物发酵床划分成横向4个单元、纵向8个单元,共取样32个空间样本,分离鉴定统计各空间样本中芽胞杆菌的种类和数量,结果表明：(1)各空间样本芽胞杆菌种类差异很大,从最多的14种(MF- 1- 3)到最少的5种(MF- 6- 3)；(2)芽胞杆菌分布在发酵床空间差异很大,有些芽胞杆菌种类分布在多个空间样本中,如阿氏芽胞杆菌(Bacillusaryabhattai)可以分布在空间样本MF- 1- 1、MF- 1- 2、MF- 1- 3、MF- 1- 4等19个空间样本中,有些种类只分布在特定的空间样本中,如海口芽胞杆菌(Bacillushaikouensis)仅分布在空间样本MF- 5- 3,居湖短芽胞杆菌(Brevibacilluslimnophilus)仅分布在空间样本MF- 4- 1等；(3)芽胞杆菌单个菌株在一个空间样本中的最大含量是环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans),分布数量为50.0×106个/g(MF- 1- 4)；含量最小的是印空研芽胞杆菌(Bacillusisronensis)等,分布数量为0.01×106个/g(MF- 4- 3)。

表3 微生物发酵床空间样本芽胞杆菌种类含量

2.2.2 微生物发酵床芽胞杆菌空间频次分布

基于表3统计,微生物发酵床芽胞杆菌种类空间出现频次分析结果见图3。芽胞杆菌种类微生物发酵床32个空间样本中出现频次差异显著,有的种类广泛分布在空间样本中,有的种类分布在少数空间样本中,其分布广泛性可分为3类：第I类为广分布种类,有8个种分布在14—29个空间样本中,分别为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)(29样本)、柯赫芽胞杆菌(B.kochii)(23样本)、甲基营养型芽胞杆菌(B.methylotrophicus)(21样本)、高地芽胞杆菌(B.altitudidns)(18样本)、阿氏芽胞杆菌(B.aryabhattai)(19样本)、环状芽胞杆菌(B.circulans)(16样本)、耐盐赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillushalotolerans)(14样本)和克劳氏芽胞杆菌(B.clausii)(14样本)。第II类为寡分布种类,有8个种分布在5—10个空间样本中,它们是特基拉芽胞杆菌(B.tequilensis)(10样本)、根际芽胞杆菌(B.rhizosphaerae)(8样本)、拾蛤鸟氨酸芽胞杆菌(Ornithinibacillusscapharcae)(8样本)、嗜盐噬糖芽胞杆菌(B.halosaccharovorans)(7样本)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)(6样本)、蜡状芽胞杆菌(B.cereus)(6样本)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)(8样本)和暹罗芽胞杆菌(B.siamensis)(5样本)。第III类为少分布种类,其余的32个种分布在1—4个空间样本中。特别注意地是类芽胞杆菌和短芽胞杆菌在这都属于少分布种类,常见的蜡状芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌属于寡分布类型的种类。

图3 微生物发酵床空间样本芽胞杆菌出现频次Fig.3 Occurrence frequency of Bacillus-like in the piggery bedding

图4 微生物发酵床芽胞杆菌数量分布多样性Fig.4 Distribution diversity of Bacillus-like species in the piggery bedding

2.2.3 微生物发酵床芽胞杆菌数量分布

基于表3统计,微生物发酵床芽胞杆菌数量分布结果见图4。微生物发酵床48种芽胞杆菌数量最大值94.11×106个/g,最小值为0.1×106个/g,平均值为8.96×106个/g。根据数量分布可将其分为4类,第I类为高含量组,优势种群,占比16.7%,数量分布在(17—94)×106个/g之间,属于该类的芽胞杆菌有环状芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、阿氏芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌、人参土芽胞杆菌(Paenibacillusginsengiterrae)、柯赫芽胞杆菌、高地芽胞杆菌和嗜盐噬糖芽胞杆菌；第II类为中含量组,常见种群,占比14.6%,数量分布在(8—13)×106个/g之间,属于该类的芽胞杆菌包含特基拉芽胞杆菌、克劳氏芽胞杆菌、尼氏芽胞杆菌(B.nealsonii)、小球状少盐芽胞杆菌(Paucisalibacillusglobulus)、伊利诺伊类芽胞杆菌(Paenibacillusillinoisensis)、枯草芽胞杆菌和耐盐赖氨酸芽胞杆菌；第III类为寡含量组,寡见种群,占比18.76%,数量分布在(3—5)×106个/g之间,属于该类的为印空研芽胞杆菌(B.isronensis)、根际芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、海洋纤细芽胞杆菌(Gracilibacillusmarinus)、蔬菜芽胞杆菌(Bacillusoleronius)、拾蛤鸟氨酸芽胞杆菌(Or.scapharcae)、青贮窖芽胞杆菌(Bacillussiralis)、蜡状芽胞杆菌和堆肥赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacilluscomposti)；第IV类为低含量组,偶见种群,占比50%,数量分布在(2—0.1)×106个/g之间,属于该类的芽胞杆菌有蜡状芽胞杆菌、暹罗芽胞杆菌(Bacillussiamensis)、海口芽胞杆菌(B.haikouensis)、霍氏芽胞杆菌(Bacillushorneckiae)、土地芽胞杆菌(Bacillushumi)、嗜常温芽胞杆菌(Bacillusmesophilum)、越南芽胞杆菌(Bacillusvietnamensis)、清国酱赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacilluschungkukjangi)、波茨坦短芽胞杆菌(Brevibacillusborstelensis)、锰矿土赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillusmanganicus)、烟酸芽胞杆菌(Bacillusniacini)、居湖短芽胞杆菌(Brevibacilluslimnophilus)、硝化短芽胞杆菌(Brevibacillusnitrificans)、长赖氨酸芽胞杆菌(L.macroides)、淤泥大洋芽胞杆菌(Oceanibacilluscaeni)、饲料类芽胞杆菌(Paenibacilluspabuli)、牛奶类芽胞杆菌(Paenibacilluslactis)、弯曲芽胞杆菌(B.flexus)、黄海芽胞杆菌(B.marisflavi)、海床类芽胞杆菌(B.oceanisediminis)、泰门芽胞杆菌(B.timonensis)、厦门芽胞杆菌(B.xiamenensis)、纺锤形赖氨酸芽胞杆菌(L.fusiformis)和巴伦氏类芽胞杆菌(Paenibacillusbarengoltzii)。

2.3 微生物发酵床芽胞杆菌空间分布型

基于表3,将4横8纵分割的32个空间样本单元内的各芽胞杆菌数量按单元分别作总和统计,考察芽胞杆菌作为一个种群在发酵床的空间分布型,统计结果见表4。结果表明：微生物发酵床空间样本单元芽胞杆菌数量分布差异很大,其中样本中数量最高的是97.6×106个/g,位于空间样本M- 4- 1,最低的是0.800×106个/g,位于空间样本M- 7- 4,平均值为13.77×106个/g。利用表3数据统计空间分布型指数见表5。空间分布型的聚集度测定结果表明,芽胞杆菌I指标=22.6183>0,为聚集分布；平均拥挤度(m*/m)指标=2.4212>1,为聚集分布；CA指标=1.4212>0,为聚集分布；扩散系数(C)=23.6183>1,为聚集分布；负二项分布K指标=1.0778>0,为聚集分布,表明芽胞杆菌在发酵床中分布为聚集分布。

研究拥挤度(m*)与平均值(m)之间的关系,用m*-m回归分析,建立m*-m回归式m*=a+bm,结果表明,m*-m回归方程(IWAO)为m*=-47.1208+5.9076m,r=0.7795；a=-47.1208<0,表明芽胞杆菌微生物个体群之间相互排斥,b=5.9076>1,表明芽胞杆菌空间分布型为聚集分布。运用幂法则分析表明,Taylor幂法则方程为lg(s)=-1.2876+3.1966lg(x),r=0.8233,b=3.1966>1,为聚集分布。

综上所述,养猪微生物发酵床芽胞杆菌空间分布为聚集分布。

2.4 微生物发酵床芽胞杆菌多样性指数

2.4.1 微生物发酵床芽胞杆菌空间分布多样性

基于表4统计,芽胞杆菌总体多样性指数结果见表6。芽胞杆菌含量范围为(0.01—9.411)×107个/g；48种芽胞杆菌总含量达4.41×108个/g；丰富度指数(D)、优势度指数(λ)、Shannon-Wiener指数(H′)、均匀度指数(J′)分别为10.49276、0.26342、1.3589、0.98027。芽胞杆菌数量达1.5×107个/g以上的种类有环状芽胞杆菌(9.411×107个/g)、地衣芽胞杆菌(7.566×107个/g)、阿氏芽胞杆菌(5.4223×107个/g)、甲基营养型芽胞杆菌(2.271×107个/g)、人参土芽胞杆菌(2.000×107个/g)、柯赫芽胞杆菌(1.972×107个/g)、嗜盐噬糖芽胞杆菌(1.710×107个/g)。

表4 微生物发酵床空间样本芽胞杆菌含量

表5 微生物发酵床芽胞杆菌空间分布型指数

表6 微生物发酵床芽胞杆菌群落多样性指数

2.4.2 微生物发酵床芽胞杆菌种类分布多样性

芽胞杆菌种类多样性指数基于表3计算,结果见表7。芽胞杆菌Shannon-Wiener指数范围0—2.88,最大的种类为地衣芽胞杆菌(2.88),最小的种类为海口芽胞杆菌、黄海芽胞杆菌、海洋芽胞杆菌等22种芽胞杆菌；优势度指数范围0.08—1,最大的种类是黄海芽胞杆菌、海洋芽胞杆菌等22种芽胞杆菌,最小的种类是地衣芽胞杆菌(0.08)；Hill指数范围1—17.75,最大的种类是地衣芽胞杆菌(17.75),最小的种类是海口芽胞杆菌、黄海芽胞杆菌、海洋芽胞杆菌等22种芽胞杆菌；芽胞杆菌丰富度指数范围0—7.71,最大的种类是,最小的种类为海口芽胞杆菌、黄海芽胞杆菌、海洋芽胞杆菌等22种芽胞杆菌；均匀度指数范围0—1,最大的种类是长赖氨酸芽胞杆菌和波茨坦短芽胞杆菌,最小的种类是黄海芽胞杆菌、海洋芽胞杆菌等22种芽胞杆菌。

2.4.3 微生物发酵床芽胞杆菌多样性指数聚类分析

芽胞杆菌多样性指数聚类分析,根据表7数据,以欧式距离为尺度,用类平均法进行系统聚类,作图5。当λ=17时,可将其分为2类：

第I类为高丰富度高含量类型,包括了7个种,即甲基营养型芽胞杆菌、耐盐赖氨酸芽胞杆菌、高地芽胞杆菌、克劳氏芽胞杆菌、阿氏芽胞杆菌、科赫芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌。

表7 发酵床芽胞杆菌种类空间分布多样性

第II类为较低丰富度较低含量类型,该类分为2个亚类,第一亚类为中等丰富度中等含量的类型,包括了10个种,即弯曲芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、暹罗芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、嗜盐噬糖芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、拾蛤鸟氨酸芽胞杆菌、根际芽胞杆菌、特基拉芽胞杆菌。第二亚类为低丰富度低含量的类型,其余的31个种。

图5 芽胞杆菌种类分布聚类分析Fig.5 Distribution analysis of Bacillus-like speceis

3 讨论

微生物发酵床养猪是近几年发展起来的一种现代化生态养猪模式和技术体系,目前在我国各地得到了广泛应用。微生物发酵床能高效分解猪粪、消除恶臭,并最终将猪粪转化形成人工腐殖质,而后者又可以进一步研制成微生物肥料、生物农药、生物育苗与栽培基质等高值产品,因此,同时实现了养猪污染的原位微生物治理和猪粪的资源化利用。在此过程中,微生物起到了关键作用。前期,作者所在课题组利用高通量宏基因组学技术分析了发酵床垫料中的微生物多样性,发现发酵床垫料中的微生物多样性极其丰富,而且存在着种类多样的芽胞杆菌(Bacillus-like)(数据待发表)。

芽胞杆菌是一类重要的微生物资源,种类繁多,可以产生多种具有抑菌功能物质,如I和II类羊毛硫抗生素(lantibiotics)[27]。因此,芽胞杆菌对猪群具有抗菌防病功能,具有作为益生菌开发的潜力。Manhar等研究发现枯草芽胞杆菌AMS6具有耐强酸(pH 2.0)和胆汁(0.3%)、高抗菌活性、抗病原菌黏附和较强的纤维素降解能力等益生菌特性,作为饲料添加剂可以增强动物纤维素消化和肠道健康[28]。Lopetuso等综述了益生克劳氏芽胞杆菌的临床应用效果、益生菌与肠道屏障相互作用、重建肠道平衡的可能作用机理[29]。大量研究表明,芽胞杆菌还具有高效降解猪粪中的有机物、抗生素、药物等及除臭、减少氨气排放等功能[30-34]。

为了进一步分析微生物发酵床垫料中可培养芽胞杆菌种群及其空间分布规律,本文通过稀释涂布平板和16S rRNA基因系统发育结合法研究垫料中的可培养芽胞杆菌空间分布多样性。结果表明：1)微生物发酵床垫料中的可培养芽胞杆菌种类极其多样,从32份微生物发酵床样品共分离获得芽胞杆菌452株,隶属于芽胞杆菌科和类芽胞杆菌科8个属的48个种；2)发酵床垫料中的芽胞杆菌呈现出非常高的丰度,其中,丰度最高的达到94.11×106个/g,最低的也达到了0.1×106个/g,平均丰度高达8.96×106个/g；3)优势芽胞杆菌种群分别为地衣芽胞杆菌、阿氏芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、柯赫芽胞杆菌、甲基营养型芽胞杆菌、高地芽胞杆菌等；4)微生物发酵床不同空间的芽胞杆菌数量分布差异很大,表现为聚集分布型。这些结果表明,芽胞杆菌是发酵床垫料中的重要微生物种群,也提示：猪粪对芽胞杆菌的富集起到了一定作用。

尽管发酵床垫料芽胞杆菌种群及其空间分布的研究较少报道,但国内外研究者在其他含有猪粪环境(如猪粪耗氧、厌氧堆肥)开展的相关研究也发现了类似结果。如,Yi等利用可培养、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和变性剂梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法分析发现猪粪堆肥过程中可培养芽胞杆菌的数量和时空分布特性随着温度的改变发生了显著地变化,枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌为优势种,在各阶段,芽胞杆菌的多样性均较低；在高温阶段堆肥各层的芽胞杆菌含量最高,而在各阶段的堆肥中间层含量均最低[35]。Guo等采用PCR-RFLP法研究发现猪粪堆肥降温阶段堆肥中间层芽胞杆菌属是优势种群,底层优势种群则为梭菌属[36]。Li等分析发现牛粪高温堆肥阶段芽胞杆菌属、地芽胞杆菌属(Geobacillus)和尿素芽胞杆菌属(Ureibacillus)是优势属,热脱氮地芽胞杆菌(G.thermodenitrificans)是优势种；在高温后期,就地堆肥地芽胞杆菌(G.toebii)和领地尿素芽胞杆菌(U.terrenus)是优势种[37]。Guo等也发现猪粪高温堆肥过程中芽胞杆菌属是各层最常见种群[38]。He等研究表明芽胞杆菌种类在鸡粪堆肥各个阶段均有较高的含量[39]。本文研究结果与上述不完全一致,发酵床垫料的优势属与上述相同亦为芽胞杆菌属,但优势种群不一致。本研究亦获得了猪粪堆肥过程中的优势种枯草芽胞杆菌和蜡质芽胞杆菌,但该2种芽胞杆菌非发酵床的优势种群。牛粪高温堆肥的优势种未在养猪发酵床垫料中发现,其种群结构与猪粪的差异很大。本研究发现养猪发酵床中仅次于芽胞杆菌属的种群为赖氨酸芽胞杆菌属,而该属在猪粪和牛粪堆肥过程皆不为优势属。微生物发酵床芽胞杆菌种类分布多样性指数不均一,可能与发酵床的发酵等级和芽胞杆菌种类对发酵床成分的适应性和利用有关。有些芽胞杆菌种类出现富集成为优势种,几乎存在于整个发酵床,如地衣芽胞杆菌,但有些适应力弱导致其数量少,仅在某些位置存在。这说明垫料发酵程度对微生物种类分布有很大的影响。薛超等发现连作会造成土壤微生物的选择适应性,出现一些种群富集,而一些种群数量降低的现象[40],进而导致不同茬次营养基质中微生物对碳源数量的利用能力出现显著差异[41]。微生物发酵床主要成分为椰糠和谷壳等高纤维材料,所构建出的生存环境适合于能降解纤维的微生物生存。叶少文等分析了微生物发酵床垫料不同深度酶活,发现垫料中纤维素酶活和半纤维素酶活性很高,揭示了一类微生物的生存空间[42]。

在养猪微生物发酵床芽胞杆菌优势种群中,地衣芽胞杆菌能够产生纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等[43-44],这些酶作用能为地衣芽胞杆菌的生存提供碳源和氮源能量来源,Mc Carthy等发现地衣芽胞杆菌是猪粪固体堆肥过程的优势可培养微生物,这就印证了本研究中地衣芽胞杆菌是养猪发酵床垫料中优势种群结果的可靠性[45]。Islas-Espinoza等发现地衣芽胞杆菌能降解猪粪中难降解的合成抗生素磺胺类药物,表明养猪微生物发酵床中大量地衣芽胞杆菌的存在在猪粪降解过程扮演着重要角色[32]。阿氏芽胞杆菌具有坚强的生命力,分布范围广。优势种高地芽胞杆菌是一种多功能芽胞杆菌,能产生碱性蛋白酶[46],可以用于固体发酵的添加菌剂[47]。优势种阿氏芽胞杆菌和高地芽胞杆菌的强大存在可能与发酵床的发酵健康程度密切相关。环状芽胞杆菌在微生物发酵床的广泛存在与发酵床具有生防抗病作用有一定的相关性。环状芽胞杆菌作为发酵床的优势种群是一种重要的动物益生菌,它不仅能产生抑制猪病原菌的物质和表面活性剂[48],同时,还可以作为堆肥发酵程度检测指标[49]。优势种嗜盐噬糖芽胞杆菌源于盐碱土壤分离,关于此菌报道甚少,属于芽胞杆菌脂肪酸群III,特性就是可以在偏盐碱性环境生存[50]。蓝江林等发现微生物发酵床垫料含盐量很高,且pH普遍在8.0—9.0之间,随着发酵时间的增加,垫料中的盐浓度和pH皆呈上升状态[51]。因此,发酵床垫料的高盐碱度很可能是导致耐(嗜)盐碱芽胞杆菌种类存在的主要原因。优势种科赫芽胞杆菌文献报道较少,该菌最初是从乳制品分离获得,有着非常宽广的生长条件,如温度范围10—40 ℃、酸碱度范围pH 6.0—10.5、盐度范围0%—10% NaCl[52],该菌的生长特性适应微生物发酵床发酵过程生长条件极端变化而广泛分布。

微生物发酵床含有丰富的微生物资源,通过微生物发酵床芽胞杆菌种群多样性分析,获得了大量的芽胞杆菌资源,这为进一步挖掘新功能和新物种提供了重要来源。关于芽胞杆菌种群变化与微生物发酵床生态功能的关联有待于进一步探讨和研究。

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SpatialdistributionpatternandcommunitydiversityoftheBacillus-likespeciesinafermentationbedsystemforpigrearing

LIU Guohong, LIU Bo*, WANG Jieping, ZHU Yujing, CHE Jianmei, CHEN Qianqian, CHEN Zheng

AgriculturalBio-ResourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China

To provide a foundation for the management of microbial fermentation beds, new resource mining ofBacillus-like species, and development of microbial agents, we investigated the spatial distribution pattern and community diversity ofBacillus-like species in the litters of a pig-on-litter system. The microbial fermentation bed was divided into 32 square areas of 4 rows × 8 columns. A sample from each area was obtained using a five-point sampling mode.Bacillus-like bacteria were isolated from the 32 samples using a culture method and preliminarily identified based on 16S rRNA gene sequences. The spatial distribution pattern of theBacillus-like bacteria was analyzed using a concentration index and regression analysis. Moreover, the Shannon-Wiener diversity index, Simpson dominance index, Hill index, and richness were separately calculated to reveal the community structure and diversity of theBacillus-like bacteria in the microbial fermentation bed. A total of 452Bacillus-like isolates were obtained from the 32 litter samples, and identified as 48 species belonging to eight genera and two Families (Bacillaceae and Paenibacillaceae) within the Bacilli by 16S rRNA gene sequences. The species numbers for the genera were as follows: 30 forBacillus, six forLysinibacillus, five forPaenibacillus, three forBrevibacillus, and one for each ofOrnithinibacillus,Oceanobacillus,Paucisalibacillus, andGracilibacillus. There was a large difference in the distribution ofBacillus-like species in the fermentation bed. On the basis of their occurrence frequency, theBacillus-like species could be discriminated as the widespread species, includingBacilluslicheniformis; sparsely distributed species, includingB.rhizosphaerae; and rare species, includingB.flexus. According to the abundance of each species, theBacillus-like species could be classified into the high-content dominant populations, includingB.licheniformis; medium-content common populations, includingLysinibacillushalotolerans; oligocontent oligo populations, includingB.rhizosphaerae, and low-content occasional populations, includingB.humi. The concentration class and regression analysis results indicated that the spatial distribution pattern of theBacillus-like species in the microbial fermentation bed was an aggregated distribution. In the litters, the content range, total content, richness, Simpson index, Shannon-Wiener index, and Pielou′s evenness index of theBacillus-like species were 0.01—94.1 × 106cfu/g, 4.41 × 108cfu/g, 0.4928, 0.2634, 1.3589, and 0.9803, respectively. Moreover,B.licheniformisappeared to have the highest Shannon-Wiener index value. On the basis of the diversity index cluster analysis, all theBacillus-like species could be divided into a high richness high content group and a low richness low content group. TheBacillus-like bacteria can actively inhabit microbial fermentation beds and have rich species and abundant contents. Thus, the microbial fermentation bed can be considered as a natural bacterial “fermentation tank,” which is expected to be directly used as a microbial inoculum and applied in the fields for purposes including soil improvement, crop disease prevention and control, and pollution management.

Bacillus-like species; piggery bedding; 16S rRNA gene; spatial distribution; diversity

国家自然科学基金(31370059)；福建省自然科学基金(2016J01129)；福建省公益项目(2015R1018- 7)；农业部948项目(2016-X21)

2016- 07- 26; < class="emphasis_bold">网络出版日期

日期:2017- 06- 01

*通讯作者Corresponding author.E-mail: fzliubo@163.com

10.5846/stxb201607261528

刘国红,刘波,王阶平,朱育菁,车建美,陈倩倩,陈峥.养猪微生物发酵床芽胞杆菌空间分布多样性.生态学报,2017,37(20):6914- 6932.

Liu G H, Liu B, Wang J P, Zhu Y J, Che J M, Chen Q Q, Chen Z.Spatial distribution pattern and community diversity of theBacillus-like species in a fermentation bed system for pig rearing.Acta Ecologica Sinica,2017,37(20):6914- 6932.