利用数字表达谱分析拟南芥叶片中盐响应基因

程 华，杨梅燕，吴佳辉，孙 楠，黄健子，郑易之，刘 昀

深圳大学生命与海洋科学学院，广东省植物表观遗传重点实验室，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳 518060

【生物工程/Bioengineering】

利用数字表达谱分析拟南芥叶片中盐响应基因

程 华，杨梅燕，吴佳辉，孙 楠，黄健子，郑易之，刘 昀

深圳大学生命与海洋科学学院，广东省植物表观遗传重点实验室，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳 518060

为揭示拟南芥在盐胁迫下基因表达谱的变化，为解决盐害提出新的方向，以哥伦比亚野生型拟南芥为材料，利用数字表达谱技术(digital gene expression profiling，DGEP)分析盐胁迫组(200 mmol/L NaCl处理2 h)和对照组的拟南芥叶片互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)文库，鉴定盐胁迫下拟南芥中差异表达的基因．结果显示，盐胁迫组中共有4 400个基因发生了差异表达，其中，1 513个基因上调表达，约占34.39%；2 887个下调表达，约占65.61%．这些基因主要富集于22个基因本体(gene ontology, GO)条目，包括核糖体构成、细胞膜和细胞器组成、应答胁迫、脯氨酸代谢等过程．进一步的KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析表明，基础代谢、次生代谢以及光合和氧化代谢等32个通路的基因显著富集．此外，本研究筛选到6个显著差异表达的胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant, LEA)基因，其中，3个LEA基因在盐胁迫条件下上调表达，3个下调表达，暗示着这6个LEA基因可能是拟南芥在应答盐胁迫过程发挥关键作用的抗逆基因．

拟南芥；LEA基因；乙烯应答因子；盐胁迫；数字基因表达谱；差异表达基因

土壤盐碱化是一种严重破坏植物生长的非生物胁迫因子[1]．盐胁迫对植物的影响主要表现为离子毒害、渗透失衡、产生氧化自由基以及积累有毒物质等．不过在长期的进化过程，植物体形成了一定的模式来适应环境的改变[2-3]．在盐胁迫过程中植物会诱导合成一系列蛋白，如离子通道蛋白、胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant, LEA)、渗调蛋白和毒性降解酶(谷胱甘肽S转移酶、可溶性环氧化物水解酶)等，以保护植物体细胞在胁迫条件下免受伤害[4]．

植物耐盐性受多基因共同调控[2-3]，分离和鉴定这些耐盐基因是植物基因资源研究的重要内容．目前很多研究是利用模式生物拟南芥作为挖掘植物抗逆基因资源的来源，通过遗传突变法、基因芯片、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)获得了5组盐超敏感(salt overly sensitive, SOS)[5-7]、分子伴侣、转录因子、小核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)[8]、参与乙烯信号通路关键基因MAPK6 (mitogen-activatedproteinkinase6)[9]和LEA基因[10]等大量的拟南芥盐胁迫响应的功能基因．其他物种耐盐基因挖掘工作也有很多，如盐胁迫下在紫花苜蓿中发现了胆汁酸：Na+共转运蛋白、LEA蛋白和转录因子等相关因子[11]；盐胁迫的下香蕉叶片中发现了3个钙调素(CaM)基因参与胁迫响应[12]；番茄响应盐胁迫基因主要集中在氨基酸代谢途径和碳水化合物途径[13]．许多关于植物抵抗逆境胁迫的实验结果都涉及众多代谢途径和大量基因，是一个复杂的过程，这在一定程度上限制了人们对植物抗逆性的研究．随着数字基因表达谱技术的应用，大量响应干旱、低温和高盐等耐胁迫基因的发现，大大地加快了植物遗传育种和新品种培育的步伐[14]．

数字表达谱技术具有不依赖基因组序列信息，数字化信号更精确、检测质量更高、检测范围广等优点，成为挖掘和研究功能基因的重要技术[14]．相对基因芯片技术，王兴春等[15]利用数字表达谱检测拟南芥不定芽时发现了一批新基因(如Clavata3/Esr-related2CLE2、ERF13和GretchenHagen3GH3等)， 同时，也发现Responseregulator5(ARR5)和RAP2.6L表达上调，与Che等[16]基因芯片结果一致．这从侧面反映了数字表达谱技术所获得的表达谱信息具有可靠性并能真实反映生物胁迫响应机制[17]，因此，数字表达谱技术成为研究植物胁迫响应基因差异表达的有效方法．目前，利用数字表达谱技术已经对大豆、盐芥和花生等植物的逆境响应基因展开了研究[18-20]，但未见利用数字表达谱技术分析拟南芥盐胁迫应答基因的报道．

本研究以哥伦比亚野生型拟南芥为材料，利用数字表达谱技术对盐胁迫处理的拟南芥在转录水平上的基因变化进行分析，全面研究盐胁迫条件下差异表达的基因及LEA基因的表达，为深入探究植物耐盐机制奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

拟南芥为哥伦比亚野生型．萌发培养基含1/2 MS、20 g/L蔗糖和8 g/L琼脂粉，pH=5.8．

1.2 方 法

1.2.1 拟南芥幼苗的培养

拟南芥种子经过消毒后点播在1/2 MS培养基平板上，4 ℃避光春化48 h后，置于温室培养．培养条件是22 ℃，16 h光照/8 h黑暗．7 d后，将幼苗转移到泥炭藓土里继续培养，到第15 天选取长势相近植株设置2组，1组幼苗正常浇水作为对照组，另1组幼苗浇浓度200 mmol/L NaCl溶液作为胁迫组，2 h后分别提取对照组和胁迫组幼叶，用作提取RNA的材料．

1.2.2 拟南芥幼苗RNA的提取和数字基因表达谱检测

利用TRIzol Reagent(Invitrogen，Carisbad，CA，USA)法提取叶片总RNA，经过琼脂糖凝胶电泳验证质量合格后，用Dynabeads Oligo(dT)25磁珠从总RNA中分离并富集mRNA．以mRNA为模板，在磁珠上合成互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)第1链，再合成第2链．用限制内切酶酶切cDNA后接上Adaptor Ⅰ，随后用Ⅱ类限制内切酶切割cDNA产生小片段，并从磁珠上释放到溶液中，再接上Adaptor Ⅱ．最后PCR扩增及对选择片段进行富集，建好文库后利用PSTAR-Ⅱ Plus测序仪(深圳华因康基因科技有限公司)进行表达谱测序．

1.2.3 数据分析

基因表达量的计算使用RPKM(reads per kilobases per million reads)法，该方法可以消除基因的长度和测序深度差异对计算基因表达量的影响，因此，可用RPKM直接比较不同样本的基因表达差异．差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)的错误发现率(false discovery rate，FDR)≤0.001，且差异表达倍数k≥2的基因．

GO功能显著性富集采用GO数据库(http://www.geneontology.org/)进行，将差异表达的基因向GO数据库的各条目(term)映射．计算每个条目的基因数目，P≤0.05为显著富集的GO term．分析GO注释的结果，寻找与生物学意义的关联性．显著性富集分析(pathway enrichment analysis)采用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库进行，将差异表达基因向KEGG数据库映射，并统计基因在每个通路的富集程度．

从拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org/)TAIR下载拟南芥LEA基因序列，通过blast2GO比对测序结果．同样用RPKM值来表示LEA基因的表达量，将FDR≤0.001，且k≥2的LEA基因认为是在HYK-1和HYK-2中差异表达的LEA基因．

2 结果与分析

2.1 数字基因表达谱测序与质量评估

本研究以浓度为200 mmol/L NaCl处理2 h样品为盐胁迫组(HYK-2)，没有盐处理样品为对照组(HYK-1)．利用数字表达谱技术进行测序，去除冗余后分别得到13 205 155和14 909 158个过滤后序列(clean reads)；能有效匹配拟南芥参考基因组序列(https://www.arabidopsis.org/)的分别为12 566 271和14 174 347个．通过进一步筛选，最终得到6 846 014和7 691 706个高质量 reads，用作DEGs的筛选．此外，HYK-1和HYK-2的 Q30 Bases 均达91.15%，其中，Q30 Bases指碱基识别正确率达99.9%.以上表明，数据产出各项统计指标较一致，未见异常．基因覆盖度分析表明两样本大致呈略带偏度的正态分布，说明测序通量基本满足表达谱分析的要求．

2.2 差异表达基因的分析

通过比对测序得到的reads和广泛通用的基因数据库(Unigene)的序列，可以得到Unigene在对应样品中的表达丰度，计算RPKM值来反映对应Unigene的表达丰度．以FDR≤0.001， 且k≥2作为筛选HYK-1及HYK-2组之间DEG的标准．当一个基因在盐胁迫组中有更高的表达水平，把该基因定义为上调表达(up-regulated)；而当一个基因在HYK-1中有更高的表达水平，则把该基因定义为下调表达(down-regulated)．由此共筛选到4 400个DEG，其中，1 513个基因上调表达，占34.39%左右，2 887个下调表达，占65.61%左右，这些在盐胁迫后表达差异的基因，可能在拟南芥的抗盐胁迫过程中发挥重要作用．

图1 正常和盐胁迫条件下拟南芥差异表达基因统计Fig.1 Statistical analysis of differentially expressed genes in Arabidopsis thaliana

通过DEG差异表达倍数分级比较可见，基因表达水平变化主要集中在4倍以内，尤其是2～4倍，这类DEG占差异表达基因总数的69.68%．而表达差异在4～30倍的基因占总DEG的24.43%，表达差异为30～1 000倍的基因占总DEG的0.25%．表达差异1 000倍以上的所有基因只有总DEG的5.64%(图1)．以上表明，胁迫条件下大多数基因表达差异发生在低水平上，仅少数基因可以发生相对较高水平表达变化．经基因功能注释后发现，这些差异1 000倍以上的差异基因主要是与蛋白调控、胁迫及能量合成有关的基因，如At5g15960、At5g03840、At5g59970、At2g40350(表1)． 此外，拟南芥在盐胁迫条件下多种转录因子的表达也发生较大变化，如At1g09540(属于MYB(myeloblastosis)家族蛋白)和At2g42150分别上调213.05和213.75； At4g28815(属于bHLH(basic helix-loop-helix)家族蛋白)和At5g67060分别下调213.79和213.77；At4g34410、At1g06160和At1g71130(属于乙烯应答因子(ethylene-responsive transcriptional factor, ERF))分别下调213.59、214.04和214.48．

表1 拟南芥盐胁迫差异表达215倍以上的基因

2.3 差异基因的GO聚类分析

GO功能分析一方面给出差异表达基因的GO功能分类注释，另一方面给出差异表达基因的GO功能显著性富集分析．为了进一步分析在HYK-1和HYK-2中的基因表达变化特征，应用超几何检验，找出了与整个基因组背景相比、在差异表达基因中显著富集的GO功能条目，由此筛选出与差异表达基因显著相关的生物学功能．

以差异基因GO条目P≤0.05为GO富集的选择标准，共筛选到22个GO具有显著性富集．其中，描述分子功能(molecular function)的有2类，描述生物过程(biological process)的有4类，描述细胞组成(cellular component)的有16类(图2)．差异基因GO聚类分析表明，差异表达基因的功能具有多样性．在盐胁迫条件下氨基酸、蛋白质的合成及蛋白质运输和光合作用等过程中，相关的酶类出现了活性降低的情况，这与杜仲叶片及大豆叶片等转录组结果相似[21-22]，说明植物转录系统是相对稳定但又高度灵敏的．这些显著富集的GO条目说明了与应答胁迫和刺激、细胞膜和细胞器组成等相关基因在拟南芥盐胁迫过程发挥重要作用．

图2 差异基因GO功能注释聚类图Fig.2 GO categories of differentially expressed genes under salt stress

2.4 差异基因的Pathway聚类分析

在KEGG数据库中对差异表达基因进行功能注释和分类，通过显著性富集能确定差异表达基因参与的主要生化代谢和信号转导途径．在Q值(P值的校正值)≤0.05为标准的显著性富集分析中，盐胁迫下总共有2 354个基因得到注释，分布于32个代谢通路中．这些差异表达基因广泛涉及4类生物大分子物质代谢、光合作用、次生代谢和氧化代谢等．其中，涉及蛋白代谢与转运通路所占比例最多，占35.84%，主要包括蛋白酶体、内吞作用、蛋白转运等过程；其次是糖代谢通路，占21.09%，如糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、果糖及甘露糖代谢途径等；光合作用相关通路如光合作用、叶绿素代谢、固氮作用等过程占11.81%；氧化磷酸化代谢如过氧化物酶体及次生产物，如维生素B6、硒化合物代谢也有发生改变．这些富集代谢途径表明，盐胁迫影响拟南芥基础代谢、次生代谢和光合及氧化磷酸化作用等各个方面，如脯氨酸积累、果糖和甘露糖积累等富集途径都是典型的渗透胁迫防御机制．总的来说，在这些能够注释到通路图的DEGs中，与糖类、蛋白、脂类和核酸等4类生物大分子代谢相关基因共占83.01%；光合作用及氧化磷酸化相关基因占15.25%；次生代谢的所占比例为1.74%．

2.5 LEA基因响应盐胁迫应答的分析

拟南芥共有51个LEA基因[10,23]，参考文献[10]对胁迫组和对照组表达的LEA基因分组结果如图3．由图3可知，HYK-1和HYK-2中分别检测到拟南芥LEA基因25个(49.02%)和27个(52.9%)， 覆盖了9个组[10]， 差异表达基因主要源自LEA-4、PvLEA18和SMP(seed maturation protein)3个组．由表2可知，HYK-1和HYK-2差异表达的LEA基因中受盐诱导的分别为15个和14个；在表达谱中没有被检测到LEA基因大部分是种子特异表达的LEA基因(如At2g18340和At2g21490)．与HYK-1相比，HYK-2中At1g02820、At5g06760和At2g36640三个LEA基因表达量上调约2.5倍，At1g01470、At2g23120和At4g36600三个LEA基因下调至原来的1/3．文献[10]报道了14个能在叶中表达的LEA基因，本研究HYK-1中检测到9个，HYK-2中7个． 这表明LEA蛋白各成员在不同盐胁迫的条件下可能发挥不同的功能或者响应信号各异．

图3 对照组和胁迫组表达的LEA基因分组Fig.3 The number of different group of LEA genes under normal and salt stress

序号基因ID样本1基因表达值样本2基因表达值差异倍数表达情况分组[10]在叶中表达[10]受盐诱导[10]1At1g01470126.4560.32-1.07-LEA-2√√2At1g028202.566.241.29+dehydrin3At1g031200.240.64×LEA-34At1g20440442.58528.19×SMP√√5At1g325600.75×LEA-46At1g526900.65×LEA-4√√7At1g544106137.553828.07×dehydrin√√8At1g721000.07×PvLEA189At1g761800.780.12×LEA-410At2g03740×AtM11At2g038500.17×AtM12At2g231101.510.84×LEA-413At2g23120416.67130.28-1.68-SMP√√14At2g336900.3×dehydrin15At2g353000.24×LEA-516At2g366400.330.881.42+LEA-417At2g401701.070.19×LEA-4√√18At2g412800.220.19×LEA-419At2g42530393.41163.71×SMP√√20At2g4254079.6259.55×SMP√√21At2g425600.21×dehydrin22At2g440601.192.2×LEA-123At2g461400.340.3×dehydrin24At3g156700.13×dehydrin25At3g225000.590.42×LEA-426At3g5097012.647.03×LEA-2√√27At3g537700.19×LEA-428At4g02380LEA-4√√29At4g132300.19×LEA-430At4g1356022.5423.27×LEA-431At4g159100.39×PvLEA18√√32At4g210200.33×LEA-433At4g366000.880.39-1.17-SMP34At5g067602.144.761.15+LEA-5√√35At5g279800.47×dehydrin36At5g66400SMP√√

1)“+”表示在HYK-2中上调表达；“-”表示在盐胁迫组中下调表达；“×”表示在HYK-1及HYK-2中表达没有差异；“表达情况”列空白表示在表达谱没有检测到；“在叶中表达”及“盐诱导”列“√”表示Hundertmark等[10]发现在叶中并受盐诱导的LEA基因，空白表示在叶中没有检测到的LEA基因且不受盐诱导．

3 讨 论

数字表达谱技术已广泛应用于许多植物的功能性基因组学研究. 文献[15,24]对拟南芥和甘蓝不定芽的数字表达谱研究发现，能与参考基因组匹配的reads分别约为92.96%和85.80%，特异匹配(unique match)约为58.76%和87.7%. 而本研究HYK-1和HYK-2各有95.16%和95.07%的reads 能比对到参考序列上，unique match分别达到51.84%和51.59%，这说明本研究测序结果和参考序列可靠；在盐胁迫条件下，本研究共获得了4 400个DEGs，结果比较理想，基因覆盖度也未见异常，说明数字表达谱测序技术能得到广泛的基因表达信息[25]，本实验的数据在质量上可靠，在测序深度上相对要好.

拟南芥在干旱、低温等胁迫条件下的差异基因主要富集在糖、脂类和蛋白等4大类基础物质代谢途径中，也有少部分富集在光合作用途径中[9]．对番茄、花生和油菜干旱应答的研究中发现了约400个干旱胁迫相关基因，包括许多转录因子和信号蛋白，如ERF、bHLH、WRKY、C2H2(Cys2/His2)型锌指蛋白、MYB 和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)等[26-28]. 本研究结果表明，盐胁迫条件下，大部分的DEG在基础代谢和光合作用途径方面占很大比重，其中，光合作用途径占11.87%，涵盖从光合作用到卟啉和叶绿素代谢等途径，且多为下调表达，与徐照龙等[29]研究结果类似．一些参与了离子转运、渗透调节、信号转导以及分子伴侣的合成等过程的基因表达量差异较大，甚至达1 000倍以上(表1)．例如，调控细胞分裂素激活信号通路的At1g31880基因表达量显著下调，这与植物在受到盐胁迫时，生长减缓，促进细胞生长与分裂的基因下调，以保存能量的特性相符[30]．但在Shen等[9]的研究结果中，参与细胞壁修饰(木质素合成和细胞壁松动等)基因上调，结合本研究调控细胞分裂素激活信号通路的At1g31880基因表达量显著下调的结果可以推测，在长期胁迫下植物细胞分裂减慢从而能导致生长减缓，而木质素合成增加，增强了植物细胞壁的刚性和不渗透性，还会提高木质化程度减少水分的蒸腾，且保持正常的膨胀压力[31-32]，从而更好地适应盐胁迫环境；同时发现转录因子MYB(At2g42150和At1g09540)上调，ERF(At4g34410、At1g06160和At1g71130)下调，与Shen等[9]结果一致，升高的转录因子有效的诱导下游防御基因，而作为乙烯信号传导中早期的ERF减少，减弱了乙烯信号的传导，减少乙烯的合成从而提高植物对盐胁迫的耐受性，许多研究认为植物对盐胁迫的耐受能力与乙烯合成呈负相关，乙烯合成越多植物对盐胁迫的耐受力越差[9]．At3g12320和At3g55740等基因上调表达，这与盐胁迫诱导能增加脯氨酸含量，减少活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量，从而加强了植物的盐胁迫抗性、降低脂质过氧化及保持膜的完整性等途径来减少盐胁迫下细胞的死亡相关[28,33]．因此，在盐胁迫下拟南芥通过改变多种代谢途径和信号通路相关基因的表达，尤其是增加部分氧化系统、渗透系统和光合系统等基因的表达，有利于其减少细胞膜和质体等细胞结构的损伤．

LEA蛋白是参与植物逆境应答的一类重要蛋白质家族．它们广泛存在于棉花、拟南芥、大豆、小麦和玉米[34]等植物中．其中，拟南芥中有51个LEA基因[10,23]．根据LEA蛋白的保守序列特性可将其分为9组[10]，各组成员的时空表达是不同的．Hundertmark等[10]通过实时荧光定量PCR发现，14个LEA基因能在拟南芥叶中表达，其中，有12个LEA基因可被干旱、冷和盐等胁迫强烈诱导表达，且LEA4可以增强植株的抗旱能力[35]．本研究共检测到34个LEA基因能在拟南芥叶中表达．在盐胁迫条件下3个上调表达，3个下调表达，28个表达没有差异．其中，有3个LEA基因(At1g02820、At2g36640和At4g36600)在盐胁迫下的差异表达是首次报道. 此外，At5g06760和At1g01470基因的表达变化与Hundertmark等[10]研究结果不一致，这可能是由拟南芥培养方法、盐胁迫浓度和时间存在差异等引起的．这些在盐胁迫条件下发生差异表达的LEA基因，可能在响应盐胁迫过程中起重要作用，使生物对渗透胁迫作出快速响应，调节细胞渗透，有效地减少伤害．

结 语

本研究以哥伦比亚野生型拟南芥为材料， 以正常培养和盐胁迫条件下的两个样品叶片进行表达谱分析，鉴定出4 400个差异表达基因，其中，1 513个基因上调表达，2 887个基因下调表达．GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能和代谢途径．筛选到6个显著差异表达的LEA基因，可能是拟南芥在应答盐胁迫过程发挥关键作用的抗逆基因，为进一步深入研究植物的耐盐机制以及LEA蛋白在植物抗逆功能中的作用奠定了基础．

致谢：感谢深圳华因康基因科技有限公司在基因表达谱分析中的帮助以及深圳大学生命与海洋科学学院姜亮博士在数据分析中的悉心指导！

引文：程 华，杨梅燕，吴佳辉，等．利用数字表达谱分析拟南芥叶片中盐响应基因 [J]. 深圳大学学报理工版，2017，34(6)：631-639.

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【中文责编：晨兮；英文责编：艾琳】

2017-05-30；Revised2017-09-20；Accepted2017-09-25

Associote professor Liu Yun．E-mail: sunshine@szu.edu.cn

DigitalgeneexpressionprofilesofArabidopsisthalianaundersaltstress

ChengHua,YangMeiyan,WuJiahui,SunNan,HuangJianzi,ZhengYizhi,andLiuYun

College of Life Sciences and Oceanography, Guangdong Provincial Key Laboratory for Plant Epigenetic, Shenzhen Key Laboratory of Microbiology and Gene Engineering, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

Salt stress is one of the most serious abiotic stresses limiting crop growth and yield. Exploring the salt stress response gene can provide a new direction for solving salt damage. In order to reveal theArabidopsisthalianagenes expression under salt stress, we explore the digital gene expression profiles (DGEP) ofArabidopsisthaliana(Columbia-0) leaves treated with water (control) or 200 mmol/L NaCl for 2 h. By comparison of gene expression of the treatment and control, 4 400 genes are identified to be differentially expressed, among which 1 513 genes are up-regulated, 2 887 genes are down-regulated. Gene ontology (GO) reveals that these genes are involved in 22 GO terms such as structural constituent of ribosome, membrane, response to stimulus, response to stress, and proline metabolism. Thirty-two pathways are enriched by Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG), including basic metabolism, secondary metabolism and oxidation-reduction processes. Meanwhile, 6 genes encoding late embryogenesis abundant (LEA) proteins are identified to express differently, which indicates that theseLEAgenes might be important in stress response process.

Arabidopsisthaliana; late embryogenesis abundant (LEA) gene; ethylene-responsive transcriptional factor (ERF); salt stress; digital gene expression profiling (DGEP); differentially expressed gene (DEG)

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31300215, 31370289 )

：Cheng Hua, Yang Meiyan, Wu Jiahui, et al．Digital gene expression profiles ofArabidopsisthalianaunder salt stress[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(6): 631-639.(in Chinese)

Q 943.2；Q 786

A

10.3724/SP.J.1249.2017.06631

国家自然科学基金资助项目(31300215, 31370289)

程 华(1992—)，男，深圳大学硕士研究生．研究方向：植物抗逆. E-mail:648577459@qq.com