标本保存温度和放置时间对D-二聚体检测结果的影响

辜淑英，李芳＊

（1.九龙坡区中医院检验科，重庆 400080；2.重庆建设医院检验科，重庆 400050）

标本保存温度和放置时间对D-二聚体检测结果的影响

辜淑英1，李芳2＊

（1.九龙坡区中医院检验科，重庆 400080；2.重庆建设医院检验科，重庆 400050）

目的探讨标本保存温度和放置时间对D-二聚体（D-Dimer,D-D）检测结果的影响。方法随机选取2016年1月-2016年2月我院住院患者30例为研究对象，抽取所有患者空腹静脉血，分离血浆后立即检测D-D，检测后血浆分成3份，分别保存在室温、2oC-8oC、-20oC（仅冻融1次），室温下保存2 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h检测D-D值；2oC-8oC保存1 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d检测D-D值；-20oC下保存1周、2周、3周、4周、5周、6周检测D-D值。分析D-D在不同保存温度、不同保存时间下的稳定性及变化趋势。结果室温下保存7 h、8 h、10 h的D-D测定值明显高于即刻值，差异有统计学意义（P＜0.05）；2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d的D-D测定值明显高于即刻值，差异具有统计学意义（P＜0.05）；-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D测定值明显高于即刻值，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同温度下，随着保存时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。结论临床对于D-D的检测应及早进行，在室温下不宜超过6 h，2oC-8oC下不宜超过3 d，-20oC下不宜超过2周；随着标本放置时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。

标本保存温度；放置时间；D-二聚体；检测结果

D-二聚体（D-Dimer,D-D）是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物，主要来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。正常人体内并无D-D存在，当机体出现凝血且继发性纤溶亢进，导致血液中出现大量的D-D，而D-D在循环体内半衰期为6 h左右[1,2]。相关研究表明[3,4]，D-D在恶性肿瘤、高血压、先兆子痫、肝脏疾病、肾脏疾病、肺血栓栓塞、弥散性血管内凝血等疾病的诊断、鉴别、病情评估、预后判断中有重要作用。但在实际工作中，临床D-D标本由护士站采集后，送到检验科进行离心后检测，从标本采集到上机检测完毕的时间长短不一，且保存温度也不一致，而在哪一段时间内及温度下检测的结果是可靠的、可以接受的，目前国内外没有明确的标准[5]。因此，本研究采用免疫比浊法对30例住院患者的D-D进行检测，分析D-D在不同保存温度、不同保存时间下的稳定性及变化趋势，探讨可靠的标本保存方式和检测时间范围，为临床提供科学、准确的诊疗依据。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2016年1月-2016年2月我院住院患者30例，男性10例，女性20例；年龄20岁-93岁，平均年龄（52.36±2.55）岁；脾胃科11例，脑病科3例，外科6例，妇产科6例，肿瘤科3例，其他1例。纳入标准：（1）临床资料完整者；（2）年龄介于18岁-95岁之间者；（3）对本研究知情，并签署同意书者；（4）依从性好，配合本次研究者；（5）胆红素≤18 mg/dL，甘油三酯≤2,000 mg/dL，血红蛋白≤500 mg/dL者。排除标准：（1）不符合上述纳入标准者；（2）患有严重传染性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 全自动血凝仪CA1500由希森美康公司提供；离心机由湖南长沙平凡仪器仪表有限公司提供；2oC-8oC冰箱由青岛海尔股份有限公司提供；-20 oC冰箱由中科美菱低温科技有限责任公司提供；D-D测定试剂盒及配套校准品、质控品均由北京九强生物技术股份有限公司提供。

1.2.2 样本采集 抽取受检者1.8 mL空腹静脉血，加入装有109 mmol/L枸橼酸钠（江苏宇力医疗器械有限公司，苏食药监械生产许可20110062）0.2 mL的塑料真空采血管内，轻轻颠倒混匀后，离心处理，转速为3,000 r/min，离心10 min，分离血浆待测。若红细胞比积（hematokrit,HCT）明显异常，抗凝剂用量应校正，校正公式如下：抗凝剂的体积=1.85×10-3×血量×（100-HCT）。

1.2.3 样本检测 标本采集后立即经免疫比浊法对D-D进行检测，此次测定值为即刻值。检测原理：通过标本中的D-D与鼠抗人D-D单克隆抗体胶乳颗粒产生抗原抗体反应，发生凝集导致浊度上升。测定浊度的变化量，计算出D-D的浓度。检测后血浆分成3份，分别保存在室温、2oC-8oC、-20oC（仅冻融1次），室温下保存2 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h检测D-D值；2oC-8oC保存1 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d检测D-D值；-20oC下保存1周、2周、3周、4周、5周、6周检测D-D值。每个标本均重复测定3次，取3次平均值作为测定值。

1.2.4 仪器校正 在全自动血凝仪上用D-D标准液和试剂作D-D定标测定，应用仪器自动倍比稀释的方法建立标准曲线。当标本D-D浓度＞1.0 μg/mL时为阳性，≤1.0 μg/mL为阴性，浓度＞30.0 μg/mL时需稀释后作进一步检测，结果等于仪器测定值乘以稀释倍数。

1.3 观察指标 比较不同放置时间的D-D测定值与即刻值之间的差异，观察其变化趋势。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件校对全组数据，计量资料采用均数±标准差表示，采用重复测量方差分析，结果Bonferroni校正；不同放置时间的D-D测定值与即刻值之间的比较，配对设计采用t检验，以时间作x，测定结果为y，进行一元一次线性回归分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 室温下D-D值 室温下保存2 h、4 h、6 h的D-D测定值范围为（2.95-3.70）μg/mL，与即刻值相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；室温下保存7 h、8 h、10 h的D-D测定值明显高于即刻值，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。测定数据均符合正态分布（见图1），将测定结果（y）与时间（x）进行一元线性回归分析，得出回归方程为y=2.635+0.235x（R2=0.226），说明在室温下，随着保存时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。

2.2 2oC-8oC下D-D值 2oC-8oC下保存1 d、3 d的D-D测定值范围为（3.00-3.70）ug/mL，与即刻值相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d的D-D测定值明显高于即刻值，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。测定数据均符合正态分布（见图2），将测定结果（y）与时间（x）进行一元线性回归分析，得出回归方程为y=5.863-0.156x（R2=0.054），说明在2oC-8oC下，D-D水平随着保存时间呈上升趋势。在2oC-8oC下，随着保存时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。见图2。

2.3 -20oC下D-D值 -20oC下保存1周、2周的D-D测定值范围为（3.20-3.70）μg/mL，与即刻值相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D测定值明显高于即刻值，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。测定数据均符合正态分布（见图3），将测定结果（y）与时间（x）进行一元线性回归分析，得出回归方程为y=5.417-0.040x（R2=0.011），说明在-20oC下，随着保存时间D-D测定值呈上升趋势。

图1 室温下放置不同小时D-D测定值正态分布图

表1 室温下放置不同小时对D-D测定值的影响（Mean±SD,μg/mL）

3 讨论

D-D是一种纤溶酶水解交联纤维蛋白形成的降解产物，其含量的变化可作为机体内原发性与继发性纤溶鉴别及高凝状态的重要指标[6]。纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统，由纤溶酶抑制物、纤溶酶、纤溶酶原激活剂及纤溶酶原组成。当纤维蛋白凝结块形成时，在纤溶酶原激活剂的作用下，纤溶酶原被激活并转化为纤溶酶，纤维蛋白开始溶解，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块，并形成纤维蛋白产物，而纤维蛋白产物由D-D、片段E、中间片段及X-寡聚体[7]。人体纤溶系统可保持血管壁正常通透性、修复组织抗原及维持血液的流动状态，若人体D-D水平上升，则说明存在继发性纤溶过程[8]。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统，投入组织型纤溶酶原活化物、尿液酶或链激酶等纤溶酶原活化物，生成大量的纤溶酶，从而溶解血栓，若D-D生成，则说明溶栓效果已达到[9-11]。由此可见，D-D的检测对于诊断与治疗纤溶系统疾病、与纤溶系统有关疾病及溶栓治疗监测具有重要意义。

D-D的测定方法较多，包括乳胶颗粒凝集实验、酶联免疫吸附实验、胶体金免疫渗滤法、自身红细胞凝集法及免疫比浊法，其中免疫比浊法、胶体金免疫渗滤法是使用最广泛的两种方法。乳胶颗粒凝集实验检测D-D优点为快速，缺点为敏感性较低、结果重复性差，主要应用于筛查中。酶联免疫吸附实验检测D-D不受血红蛋白、胆红素、纤维蛋白产物及纤维蛋白原干扰，其优点为敏感性、准确性高，缺点为操作步骤复杂、费时、每次实验需带标准曲线及抗原抗体反应受温度时间影响，因此不适用于临床病人及时诊断及治疗。胶体金免疫渗滤法检测D-D优点为操作简便、可定量、灵敏度高及快速，缺点为特异性不强、受脂质颗粒干扰[12]。自身红细胞凝集法检测D-D优点是可用全血检测，省去了离心制备血浆的麻烦。免疫比浊法检测D-D具有重复性好、操作简单、可定量、人为因素少等优点，但对于仪器的要求较高。本研究采用了灵敏度高、能快速定量检测的免疫比浊法对D-D进行检测。由于实际工作中，临床D-D标本从采集到上机检测完毕的时间长短不一，且保存温度也不一致，有可能造成D-D水平出现变化。而本研究结果也表明，室温下保存7 h、8 h、10 h和2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d及-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D测定值高于即刻值，且随着标本放置时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。提示临床对于D-D的检测应及早进行，在室温下不宜超过6 h，2oC-8oC下宜超过3 d，-20oC-20oC下不宜超过2周。分析可能为随着D-D标本保存时间的延长及温度的上升，血浆中的凝血因子被活化，并对纤溶酶进行激活，导致交联纤维蛋白的形成并发生降解，从而造成D-D水平的上升。

本研究通过对不同保存温度、不同保存时间下的D-D标本进行检测，分析其稳定性及变化趋势，为临床更准确的测定D-D值提供依据。但由于本研究收集样本不多，结果可能存在偏倚，临床需加大样本数量进一步探讨。

综上所述，临床对于D-D的检测应及早进行，在室温下不宜超过6 h，2oC-8oC下宜超过3 d，-20oC-20oC下不宜超过2周；随着标本放置时间的延长，D-D测定值呈上升趋势。

图2 室温下放置不同天数D-D测定值正态分布图

图3 室温下放置不同周D-D测定值正态分布图

表2 2 oC-8 oC下放置不同天数对D-D测定值的影响（Mean±SD,μg/mL）

表3 -20 oC下放置不同周对D-D测定值的影响（Mean±SD,μg/mL）

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Influence of specimen storage temperature and storage time on test results of d-dimer

Shuying GU1,Fang LI2＊

1Traditional Chinese Medical Hospital of Jiulongpo District,Chongqing 400080,China;2Department of Clinical Laboratory,Chongqing Jianshe Hospital,Chongqing 400050,China

ObjectiveTo investigate the influence of specimen storage temperature and storage time on test results of D-dimer (D-D).Methods30 inpatients in our hospital from January 2016 to February 2016 were selected as research object,the fasting vein blood of all patients were taken,the D-D was instantly detected after plasma separation.After detection,the plasma was divided into 3 samples and stored at room temperature,in 2oC-8oC,-20oC (freezing and thawing only once).The samples were stored at room temperature 2 h,4 h,6 h,7 h,8 h,10 h and were detected D-D value; The samples were stored in 2oC-8oC 1 d,3 d,5 d,6 d,7 d,8 d,9 d and were detected D-D value; The samples were stored in -20oC 1 wk,2 wk,3 wk,4 wk,5 wk,6 wk and were detected D-D value.The stability and variation trend of D-D in different storage temperature and storage time were analyzed.ResultsThe D-D measured value which stored at room temperature 7 h,8 h,10 h were significantly higher than instant value (P＜0.05); The D-D measured value which stored in 2oC-8oC 5 d,6 d,7 d,8 d,9 d were significantly higher than instant value (P＜0.05); The D-D measured value which stored in -20oC 3 wk,4 wk,5 wk,6 wk were significantly higher than instant value (P＜0.05); Under different temperature,as storage time extended,the D-D detection value showed rising trend.ConclusionClinical D-D detection should be early took,and it should be at room temperature but no more than 6 h,in 2oC-8oC but no more than 3 d,in -20oC but no more than 2 wk; As specimen storage time extends,the D-D detection shows rising trend.

Specimen storage temperature; Storage time; D-dimer; Test results

重庆市卫计委014年医学科研指导项目（No.20143036）