饲料中添加谷氨酰胺前体物对镜鲤肠道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影响

赵志刚，宋芳杰，2，王连生，罗 亮，王常安，李晋南，都 雪，徐奇友

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214182)

饲料中添加谷氨酰胺前体物对镜鲤肠道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影响

赵志刚1，宋芳杰1，2，王连生1，罗 亮1，王常安1，李晋南1，都 雪1，徐奇友1

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214182)

为了研究谷氨酰胺前体物对镜鲤(Cyprinuscarpiospecularis)肠道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影响，分别用谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、α-酮戊二酸(AKG)、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)、α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)替代基础饲料中的葡萄糖(添加量为1.5%)，配制成6种等氮等能试验饲料，以基础饲料为对照，分别投喂松浦镜鲤(平均体重(40.27±3.96)g)，饲养8周后测定镜鲤肠道消化酶及Na+/K+-ATPase活性。结果显示：Glu组前肠蛋白酶活性显著高于对照组；Gln组、Glu组、OKG组和AAKG组中肠蛋白酶活性均显著高于对照组。2Na-AKG组前肠脂肪酶活性显著高于对照组和OKG组；2Na-AKG组中肠脂肪酶活性显著高于对照组和Gln组。2Na-AKG组前肠淀粉酶活性均显著高于对照组和Gln组。Gln组和Glu组前肠Na+/K+-ATPase活性均显著高于对照组；不同处理组中肠Na+/K+-ATPase活性均显著低于对照组；Glu组、AKG组和OKG组后肠Na+/K+-ATPase活性均显著高于对照组，Gln组、AAKG组和2Na-AKG组后肠Na+/K+-ATPase活性则均显著低于对照组。研究表明，饲料中添加Gln、Glu、OKG和AAKG可显著提高鱼体肠道的蛋白酶活性，添加2Na-AKG可显著提高鱼体肠道的淀粉酶和脂肪酶活性。

谷氨酰胺；前体物；镜鲤(Cyprinuscarpiospecularis)；消化酶；Na+/K+-ATPase

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是动物机体内含量最丰富的游离氨基酸，在机体内参与多种代谢物质的合成，可为机体中快速分裂的细胞提供能量，也是体内蛋白质和氨基酸的重要来源[1-3]。通常动物机体内 Gln 可以内源合成或通过外源添加获得，但当机体处于病理或应激状态时，内源Gln的合成量远不能满足机体的正常需求，从而导致机体内 Gln 相对缺乏[4]。研究表明，饲料中添加外源性Gln 能够改善鱼体肠道结构和功能，促进肠道发育[5-6]。然而，外源性 Gln 极不稳定，受热后容易分解生成有毒物质[7]。鉴于此，不同学者对其相关替代物进行了深入研究[8-9]。从代谢角度看，Gln 的前体物，如谷氨酸(Glu) 、 α-酮戊二酸(AKG) 、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG) 、α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸 (OKG) 等都可能在动物机体中与Gln发挥相同或相似的功能。李晋南等[10-11]对鲤鱼的研究表明，饲料中添加AKG、OKG、Glu可显著影响鱼体肠道的消化酶活性及肠道发育。魏玉强等[12]研究表明，饲料中添加 AKG 能够促进鲤鱼对饲料中蛋白质的同化利用。

松浦镜鲤(Cyprinuscarpiospecularis)作为成功选育出的一个经济新品种，由于其较好的体型优势和经济性状，在全国范围内已被广泛养殖[13]。本试验选择了几种 Gln 的代表性前体物Glu、AKG、OKG、AAKG和 2Na-AKG，研究Gln及其前体物对松浦镜鲤肠道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影响，旨在为鲤饲料的科学配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲料配制

试验用鱼来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。选择3 000尾规格整齐、体质健壮的松浦镜鲤，在循环水养殖系统中暂养并驯化1周。暂养期间每日于07：30、12：30、16：30饱食饲喂基础饲料；每天换水20 %，维持水温在(25.0±2.0) ℃，溶氧浓度高于5.0 mg/L。

以鱼粉和豆粕作为蛋白源，鱼油、豆油和磷脂作为脂肪源，根据NRC(2011)及《鲤鱼配合饲料》(SC/T1026-2002)要求配制基础饲料。分别用谷氨酰胺、谷氨酸(Glu)、α-酮戊二酸、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸、L-精氨酸-α-酮戊二酸、α-酮戊二酸钠替代基础饲料中的葡萄糖(添加量为1.5 %)，配制成6种等氮等能实验饲料。表1列出了饲料的基础组成及营养水平。将饲料原料粉碎并称重，逐级混合均匀后，制成颗粒饲料(粒径为2 mm)，在常温条件下风干，4 ℃冰箱保存备用。OKG(AKG与L-鸟氨酸质量比为1∶1)、2Na-AKG、L-Glu、AAKG(AKG与L-精氨酸质量比为1∶2)和L-Gln均购自上海鼓臣生物技术有限公司，AKG购自Sigma公司，纯度均大于或等于98.0 %。

1.2 试验方法及管理

驯化结束后，挑取平均体重(40.27±3.96)g的松浦镜鲤1 050尾，随机将其分成7组，每组设5个重复，每个重复30尾鱼。6个试验组均随机饲喂1种试验饲料，对照组饲喂基础饲料。试验鱼在室内循环水系统内养殖，养殖缸高0.6 m、直径1.2 m，每天于07：30、12：30、16：30饱食投喂3次。养殖期间，系统内每天换水20 %，水温保持在(25.0±2.0) ℃，溶解氧不低于5.0 mg/L。养殖期为8周。

1.3 样品采集及指标测定

养殖试验结束后将试验鱼饥饿24 h，之后进行采样。每缸随机取出2尾试验鱼用丁香油麻醉后，置于冰盘上解剖，分别取前中后肠道，用预冷的0.86%生理盐水清洗肠道并用滤纸吸干，保存于盛有波恩氏液的5 mL离心管中，4 ℃保存待测。准确称取试验鱼样品，与预冷的0.86%生理盐水按1∶9的比例(质量体积比)稀释，匀浆，按不同检测指标所需条件及试剂盒要求的速度和时间进行离心，离心后取组织上清液样品-20 ℃保存待测。

表1 干物质基础饲料组成及营养水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet in dry materiel %

注：1)维生素预混料为每千克饲料提供：VE 60 mg，VA 8 000 IU，VB615 mg，VC 500 mg，VB120.5 mg，VB230 mg，VD33 000 IU,VK35 mg，氯化胆碱5 000 mg，泛酸 50 mg，烟酸175 mg，叶酸 5 mg，肌醇 1 000 mg，D-生物素 2.5 mg。

2)矿物质预混料为每千克饲料提供：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，Fe 25 mg，Mn 15 mg。

3) 粗脂肪和粗蛋白质均为实测值，其余为计算值。

蛋白酶(U/g prot)活性测定采用福林-酚(Folin-phenol)法。

脂肪酶(U/g prot)、淀粉酶(U/g prot)和Na+/K+-ATP酶(μmol Pi/(mg prot·hour))活性测定严格按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。

1.4 统计分析

数据采用平均值±标准误(mean ± S.E.)表示，通过SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，对差异显著的数据采用Duncan氏法进行多重比较检验，差异显著性的标志为P<0.05。

2 结果

2.1 谷氨酰胺前体物对镜鲤蛋白酶活性的影响

不同谷氨酰胺前体物对松浦镜鲤肠道蛋白酶活性的影响见表2。与对照组相比，Glu组鱼体前肠蛋白酶活性显著较高，而前肠蛋白酶活性在其它各组之间差异均不显著。Gln组、Glu组、OKG组和AAKG组鱼体中肠蛋白酶活性均显著高于对照组。各处理组鱼体后肠蛋白酶活性与对照组相比差异均不显著，而AKG组和OKG组后肠蛋白酶活性均显著高于AAKG组和2Na-AKG组。

2.2 谷氨酰胺前体物对镜鲤脂肪酶活性的影响

谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肠道脂肪酶活性的影响见表3。2Na-AKG组鱼体前肠脂肪酶活性显著高于对照组、AKG组和OKG组；2Na-AKG组鱼体中肠脂肪酶活性显著高于对照组和Gln组，其他各组间差异不显著。与对照组相比，Glu组、AKG组、AAKG组和2Na-AKG组鱼体后肠脂肪酶活性均显著较低。

2.3 谷氨酰胺前体物对镜鲤淀粉酶活性的影响

谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肠道淀粉酶活性的影响见表4。2Na-AKG组鱼体前肠淀粉酶活性显著高于对照组和Gln组，其他各组间差异均不显著。与对照组相比，其它各处理组鱼体中肠和后肠的淀粉酶活性差异均不显著，Gln组和AAKG组中肠淀粉酶活性显著高于AKG组。

2.4 谷氨酰胺前体物对镜鲤Na+/K+-ATPase活性的影响

与对照组相比，Gln组和Glu组鱼体前肠Na+/K+-ATPase活性均显著较高，其他各组与对照组相比差异均不显著(表5)。不同处理组鱼体中肠Na+/K+-ATPase活性均显著低于对照组。在后肠中，Glu组、AKG组和OKG组鱼体Na+/K+-ATPase活性均显著高于对照组，而Gln组、AAKG组和2Na-AKG组Na+/K+-ATPase活性则均显著低于对照组。

表2 不同谷氨酰胺前体物对松浦镜鲤肠道蛋白酶的影响 (n=10)Tab.2 Effects of different precursors of Gln on intestinal protease of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

注：同列无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

表3 不同谷氨酰胺前体物对松浦镜鲤肠道脂肪酶的影响 (n=10)Tab.3 Effects of different precursors of Gln on intestinal lipase of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

表4 不同谷氨酰胺前体物对松浦镜鲤肠道淀粉酶的影响 (n=10)Tab.4 Effects of different precursors of Gln on intestinal amylase of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

表5 不同谷氨酰胺前体物对松浦镜鲤肠道Na+/K+-ATPase的影响 (n=10)Tab.5 Effects of different precursors of Gln on intestinal Na+/K+-ATPase of songpu mirror carp，Cyprinus carpio specularis (μmol Pi/mg prot·h)

3 讨论

肠道是鱼类特别是鲤鱼等无胃鱼营养物质消化吸收的主要场所。肠道生长发育以及其中的消化酶活性均与机体生长发育和营养物质的吸收息息相关。鱼类肠道中蛋白质和脂肪的主要消化酶是胰腺分泌的蛋白酶和脂肪酶，两种酶均以酶原形式进入肠道，再由肠道中的胆盐等相应物质激活，因此肠道中蛋白酶和脂肪酶活力也能反映出胰腺消化酶分泌能力[14-15]。研究结果表明，鱼体前肠和中肠蛋白酶活性远高于后肠，说明松浦镜鲤对蛋白质的主要消化区域在前中肠；而鱼体中后肠脂肪酶和淀粉酶活性远高于前肠，说明鱼体对脂肪和淀粉主要消化区域集中在中后肠。

黄晓亮等[16]研究表明，肉鸡饲料中外源添加Gln可显著提高小肠蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。吴高齐等[17]在饲料中添加Gln显著提高了野猪仔猪胰腺脂肪酶活性。Lin等[5]在饲料中添加Gln可显著提高幼建鲤前、中、后肠道蛋白酶和脂肪酶活性。随着研究的不断深入以及对谷氨酰胺特性的了解，本实验室对谷氨酰胺替代物及前体物进行了进一步的研究。李晋南等[11]研究表明，饲料中添加Gln、Glu和OKG均能一定程度地提高松浦镜鲤肠道蛋白酶和脂肪酶活性，而OKG显著提高了淀粉酶的活性。位莹莹[18]在松浦镜鲤饲料中添加AKG显著提高了肠道消化酶活性。陈迪等[19]在杂交鲟饲料中添加AKG可显著提高其肠道蛋白酶活性。魏玉强[20]在不同蛋白源饲料中添加1.5%AKG显著提高了松浦镜鲤前肠和中肠蛋白酶和脂肪酶活性。本研究中结果表明，不同添加剂对大规格松浦镜鲤鱼种肠道消化酶活性均有一定程度的影响，其中Gln、Glu、OKG和AAKG可显著提高鱼体肠道蛋白酶活性，对饲料蛋白质消化能力的提高提供保障，2Na-AKG可显著提高鱼体肠道淀粉酶和脂肪酶活性，更有利于鱼体对饲料淀粉和脂肪的消化。

鱼类肠道管腔内表面有很多褶皱以及肠绒毛，可以增大食物与肠道的接触面积和肠液的分泌面积，其与食物的消化吸收密切相关。肠道内Na+和K+的转运是逆浓度梯度进行的，转运过程需要能量的支持，而Na+/K+-ATPase可分解ATP为其提供能量，一些营养物质的吸收与Na+和K+的吸收通过Na+/K+-ATPase相偶联，如氨基酸、葡萄糖等。研究表明，Na+/K+-ATPase活性是肠黏膜生长发育的重要标志[21-22]。Lin等[5]研究表明，饲料中添加1.2%的Gln对建鲤肠道Na+/K+-ATPase活力有显著影响。徐奇友等[23]在饲料中添加0.5% Gln，哲罗鱼肠道Na+/K+-ATPase活力提高了71%。本研究结果显示，不同添加剂对松浦镜鲤肠道Na+/K+-ATPase活性的影响均不相同，添加Gln和Glu可显著提高鱼体前肠Na+/K+-ATPase活性，而添加AKG和OKG则可显著提高鱼体后肠Na+/K+-ATPase活性。

综上所述，饲料中添加Gln、Glu、OKG和AAKG可显著提高松浦镜鲤肠道蛋白酶活性，对饲料蛋白质消化能力的提高提供保障，2Na-AKG可显著提高鱼体肠道淀粉酶和脂肪酶活性，更有利于鱼体对饲料淀粉和脂肪的消化。

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TheeffectsofadditionsofGlnanditsprecursorsondigestiveenzymeandNa+/K+-ATPaseactivitiesofintestineinCyprinuscarpiospecularis

ZHAO Zhi-gang1，SONG Fang-jie1，2，WANG Lian-sheng1，LUO Liang1，WANG Chang-an1，LI Jin-nan1，DU Xue1，XU Qi-you1

(1.HeilongjiangRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Harbin150070，China；2.WuxiFisheriesCollege，NanjingAgriculturalUniversity，Wuxi214182，Jiangsu，China)

This study aimed to investigate the effects of Gln and its precursors on digestive enzyme and Na+/K+-ATPase activities of intestine inCyprinuscarpio.Seven isoproteic and isolipidic diet treatments including glucose (control)，glutamine (Gln)，glusate (Glu)，α-ketoglutarate (AKG)，L-ornithine-α-ketoglutarate (OKG)，L-arginine-α-ketoglutarate (AAKG) and α-ketoglutarate sodium (2Na-AKG) were conducted.Healthy carps with an average initial weight of (40.27 ± 3.96) g were randomly assigned to thirty-five aquaria with an initial stocking density of 30 fish per aquarium and cultured for 56 days.The results showed the protease activities in the foregut of fish in the Glu group were significantly higher than that in the control.The protease activities in the midgut of fish in the Gln group，Glu group，AAKG group and OKG group were significantly higher than those in the control.The lipase activities in the foregut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and OKG group，while the lipase activities in the midgut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and Gln group.The amylase activities in the foregut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and Gln group.The activities of Na+/K+-ATPase in the foregut of fish in the Gln group and Glu group were significantly higher than those in the control.The activities of Na+/K+-ATPase in the midgut of fish in all the treatments were significantly lower than that in the control.The activities of Na+/K+-ATPase in the hindgut of fish in Glu group，AKG group and OKG group were significantly higher than those in the control，while the activities of Na+/K+-ATPase in the hindgut of fish in Gln group，AAKG group and 2Na-AKG group were significantly lower than those in the control.The protease activities in fish can be significantly improved when Gln，Glu，OKG and AAKG were added to feed，while the lipase and amylase activities in fish can be significantly improved when 2Na-AKG were added to feed.

glutamine；precursor；Cyprinuscarpiospecularis；digestive enzyme；Na+/K+-ATPase

2017-04-24；

2017-08-03

中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2016HY-ZD0602；2016HY-JC02-02；2014A08XK03)；国家大宗淡水鱼产业技术体系(CARS-46)；国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD25B09)

赵志刚(1982- )，男，助理研究员，博士，主要研究方向为水产养殖生态。E-mail：zhaozhigang@hrfri.ac.cn

徐奇友。E-mail：xuqiyou@sina.com

S963.73

A

1000-6907-(2017)06-0088-06