克氏原螯虾对高温应激的生理学响应

徐 进，魏开金，徐 滨，马宝珊，朱祥云

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223)

克氏原螯虾对高温应激的生理学响应

徐 进，魏开金，徐 滨，马宝珊，朱祥云

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223)

本实验旨在研究高温对克氏原螯虾(Procambarusclarkia)血液生化指标、抗氧化能力以及热休克蛋白70基因表达的影响。实验分别采用30 ℃和35 ℃水温进行高温应激试验，应激前(0 h)和在应激后3、6、12、24和48 h分别采集样本，测定血淋巴液中LDH、GLU、TCHO、TP和TG含量，测定肝胰腺T-AOC、CAT、MDA以及HSP70基因的表达变化。结果显示：在高温应激的初级阶段(6 h)，克氏原螯虾血淋巴中的TCHO和LD含量急剧上升，而GLU含量持续上升到24 h；TG含量在应激的初级阶段变化不明显，但在6 h后急速上升，在12 h达到最高后开始回落；TP的含量在初级阶段出现下降，然后在12 h恢复至应激前水平。肝胰腺中的MDA含量在应激后持续上升，在24 h后达到最高值，随后下降至应激前水平；T-AOC在应激后3 h上升至最高水平，随后降低；CAT的含量分别在应激后6 h和12 h上升至最高值然后回落。HSP70基因在应激前未检测到有表达，高温应激后3 h即可检测到少量表达，35 ℃组在6 h出现大量表达，并持续到12 h，随后24 h降低至无法检出；而30 ℃组在应激 6 h后降低至无法检出。结果表明，30 ℃和35 ℃高温能引起克氏原螯虾机体产生应激反应，并对机体的生理机能产生影响。

克氏原螯虾(Procambarusclarkia)；高温应激；生化指标；抗氧化；热休克蛋白70

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)又称小龙虾、红色沼泽螯虾或克氏螯虾，是我国目前重要的淡水养殖虾类。近年来，由于克氏原螯虾国内消费激增，市场需求旺盛，促使克氏原螯虾人工养殖发展迅猛，特别是在湖北、安徽、江苏等地被大规模人工养殖。统计资料显示，我国已成为世界最大的克氏原螯虾生产国，2016年全国克氏原螯虾养殖面积超过60万hm2，总产量达89.91万t(含捕捞产量)，产值达564.1亿元，经济总产值1 466.1亿元[1]。然而，随着养殖规模的扩大，病害问题也日益严重[2-5]。特别是在每年的高温季节，病害问题尤为突出，造成巨大的经济损失。疾病的频发可能跟环境应激有关。本文探讨了克氏原螯虾在30℃和35℃的应激温度下机体生理生化指标的变化以及热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)基因的表达变化，以揭示高温应激对克氏原螯虾生理机能的影响，为克氏原螯虾的健康养殖技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验克氏原螯虾及其饲养方法

试验用克氏原螯虾为捕自武汉市梁子湖的野生克氏原螯虾，试验前暂养1周，挑选活力强、无病无伤、规格基本一致(体重(30±5)g)的克氏原螯虾用于试验。养殖用水为曝气3 d以上的自来水，水温(25±2) ℃，每日换水一次，暂养期间按虾体重的5%左右投喂商品虾料，试验期间不投喂、不换水。

1.2高温应激试验

取上述规格基本一致的克氏原螯虾，分别采用30 ℃和35 ℃水温进行高温应激试验。每个温度组设置一个平行组，每组50尾克氏原螯虾，放于规格为70 cm×50 cm×40 cm的控温水箱中，连续应激48 h，实验期间持续充氧，并减少人为干扰，避免额外应激。

1.3血淋巴液、肝胰腺的采集与指标测定

每组分别于应激前(0 h)以及应激后3、6、12、24、48 h等时间节点各取3尾虾，将虾迅速捞起并于围心腔抽取0.5 mL血淋巴液，随即剥开头胸甲取1 g左右肝胰腺组织。用于测定生理生化指标的血淋巴液用同等体积的5%肝素钠抗凝，并随后于4 ℃、3 000g离心10 min，留取血浆于-80 ℃保存待测。血淋巴液中的乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TCHO)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)等指标在希森美康全自动生化分析仪(chemix-800)上测定。肝胰腺组织分2份，一份用于抗氧化酶类指标的测定，一份用于分子生物学测定，均保存于-80 ℃。应激相关酶类指标测定时，取出冷冻样本于冰上解冻后加入适量磷酸缓冲液(PBS，sigma产品)冰浴匀浆，匀浆液于4 ℃、10 000g离心20 min，取上清液于-20 ℃保存待测。肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)均采用检测试剂盒测定[6]，上述试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。肝胰腺匀浆液蛋白浓度采用福林酚方法测定，以牛血清白蛋白(BSA)作标准蛋白。

1.4肝胰腺HSP70mRNA测定

取约0.1 g在-80 ℃保存的肝胰腺，使用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，参照其说明书进行。克氏原螯虾肝胰腺HSP70 mRNA的测定参照孙勇等的半定量法[7]进行。HSP70扩增引物为PF：5’-GGTGTTGGTGGGAGGGTCTA-3’，PR：5’-GGCTCGCTCTCCCTCATACAC-3’，片段大小343bp；内参基因β-Actin扩增引物为Actin F：5’-AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGAC-3’，Actin R：5’-TTCTCCATGTCGTCCCAGT-3’，片段大小240 bp。上述引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

逆转录反应采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，逆转录反应液为：1 μL Oligo(dT)18引物(0.5 μg/μL)；0.5 μg RNA模板；2 μL dNTPs(10 mmol/L)；4 μL 5×Buffer；1 μL RiboLockTMRNA酶抑制剂(20 U/μL)；1 μL RevertAidTMM-MuLV逆转录酶(200 U/μL)；加DEPC水至20 μL。反应液混匀后，42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min终止反应。PCR扩增采用rTaq酶(Takara)，具体反应液为：2 μL cDNA；5 μL 10×Buffer；2 μL dNTPs(10 mmol/L)；正反向引物(10 μmol/L)各1 μL；1 μL rTaq酶(5 U/μL)；加纯水至50 μL。反应条件为预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，34个循环后72 ℃延伸5 min，2%琼脂糖凝胶电泳检测，用GelDoc EQ凝胶成像系统成像分析。

1.5数据统计与分析

数据用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和DUNCAN多重比较，所有结果均以平均值±标准差来表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1高温应激对克氏原螯虾血淋巴液生化指标的影响

分别在30 ℃和35 ℃的高温应激下，随着应激时间的延长，克氏原螯虾血淋巴液中的LDH、GLU、TCHO、TP、TG都有不同程度的变化(见表1)。在30 ℃温度下，克氏原螯虾血淋巴液中的LDH含量在3 h后显著升高，然后逐渐降低，在第48 h后其含量恢复到应激前水平。而在35 ℃高温应激下，血淋巴液中的LDH含量在第6 h后升高到最高点，其升高持续时间比30 ℃应激组长3 h，随后下降并在48 h后恢复到应激前水平。30 ℃和35 ℃高温应激后6 h，克氏原螯虾虾血淋巴液中的TCHO含量均出现上升趋势，6 h后出现下降趋势，48 h后恢复到应激前水平，其中30 ℃较35 ℃下降更显著。血淋巴液中的GLU含量随着高温应激时间的延长而逐渐升高，30 ℃温度下在第12 h达到最高点，随后保持高位浓度；而35 ℃温度下在第24 h达到最高点，随后显著下降。血淋巴液中的TP含量在高温应激后逐渐降低，并在第6 h后达到最低值，随后出现反弹上升。30 ℃温度下TP含量在第12 h升高到最高点，与应激前水平差异不显著，随后变化不显著；35 ℃温度下在第24 h升高到最高点，并与应激前水平差异不显著。血淋巴液中的TG含量在高温应激的前6 h变化不明显，随后显著升高并在12 h达到最高点，随后下降并在48h恢复到应激前水平。

表1 高温应激对克氏原螯虾血液生化指标的影响

注：表中数值为平均数±标准差(n=6)。同一行数据右上角的不同字母表示DUNCAN多重比较下的差异显著(P<0.05。表2同)

2.2高温应激对克氏原螯虾肝胰腺中抗氧化酶的影响

在35 ℃和30 ℃温度下，随着时间的延长，克氏原螯虾肝胰腺的T-AOC、CAT以及MDA等抗氧化相关指标的含量与应激前相比都有显著变化(见表2)。在高温应激试验的3 h，克氏原螯虾肝胰腺的T-AOC达到最高，随后逐渐降低，但35 ℃组降低速度明显低于30 ℃组，且在第48 h仍未恢复到应激前水平。克氏原螯虾肝胰腺中CAT的浓度随着应激时间的延长而逐渐增加，其中35 ℃组CAT的浓度于应激后12 h达到最高，随后降低；30 ℃组于应激后6 h达到最高，随后缓慢降低。克氏原螯虾肝胰腺中MDA的浓度随着应激时间的延长而持续增加，并于24 h达到最高，随后快速降低，其中35 ℃组下降速度明显较30 ℃组快。

2.3高温应激对克氏原螯虾肝胰腺中HSP70基因表达的影响

如图1所示，在应激前未检测到有HSP70基因的表达。在35 ℃温度应激下，克氏原螯虾肝胰腺中HSP70基因在应激后3 h即出现少量表达，随后到6 h出现大量表达，并持续到12 h，随后24 h降低至无法检出。而30 ℃下，克氏原螯虾肝胰腺中HSP70基因在应激后3 h出现少量表达，随后到6 h后降低至无法检出。

表2 高温应激对克氏原螯虾肝胰腺中抗氧化酶的影响

图1 克氏原螯虾肝胰腺中HSP70基因在高温应激下的表达变化

3 讨论

应激是生物适应性的一种表现形式，适度的应激可增强动物机体对环境的适应能力，而过度的应激则会引起机体正常生理功能的紊乱，导致机体免疫力低下进而导致疾病的发生[8]。虾是低等无脊椎动物，其生理功能更容易受到环境的影响。本研究检测了高温饲养条件下，克氏原螯虾血淋巴液生化指标、肝胰腺中抗应激相关酶类以及HSP70基因的表达差异，证实了30 ℃和35 ℃高温的确能引起克氏原螯虾机体产生应激反应。由于克氏原螯虾的最适生长温度为21～28 ℃[9]，30 ℃和35 ℃引起的高温应激必定对其机体的生理功能产生一定的影响。

从生理学的角度，应激反应的发展过程通常分为初级、次级和第三级应激反应[10]。

初级反应主要包括机体对应激源的识别及生物防御的启动，是机体在神经和内分泌系统水平上的反应，表现在血淋巴液中的儿茶酚胺和皮质醇等应激激素水平的升高[11]。本研究中克氏原螯虾血液中的TCHO水平在高温应激后的前6 h持续增加，6 h后开始降低，表明应激后的6 h为克氏原螯虾高温应激的初级反应阶段。

次级反应阶段是由初级反应阶段所产生的应激激素调控的一系列生理生化反应过程，包括呼吸系统、血液系统、能量代谢、电解质平衡以及免疫系统等生物学功能的改变。此阶段机体代谢的一个重要特征是以葡萄糖为代表的能量物质的代谢变化以应对应激[12]。本研究中克氏原螯虾血淋巴的GLU含量随着高温应激时间的延长持续上升，分别在第12 h(30 ℃)和24 h(35 ℃)达到最高值，随后降低。GLU含量的持续上升表明机体在应激状态下需要更多的能量以应对应激压力，因此在相关激素和酶的调控下加强了GLU的合成。对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的研究表明[13]，皮质醇可以增强糖原合成有关酶的活性，进而大大加强糖原的异生，使血糖升高。LDH是参与糖无氧酵解和糖原异生的重要酶。本研究中，在应激反应的初级阶段，LDH的浓度大幅升高，开始了糖原合成的一系列生化反应，最终使克氏原螯虾机体的血糖浓度持续增加。除了糖，脂肪和蛋白质也是动物能量代谢重要物质。TG是脂肪的分解成分，是机体能量的重要来源，本研究中，克氏原螯虾血液中的TG含量在应激的初级阶段变化不明显，但到次级阶段后显著升高并在12 h达到最高点，表明克氏原螯虾机体为了应对应激，加速了脂肪的分解以提供能量。TP含量的变化通常反映了机体生理和病理变化。在本研究中，原螯虾血液中的TP含量在初级阶段逐渐降低，推测是由于应激引起的蛋白质消耗引起的。随后在次级阶段，TP含量开始持续升高，表明机体的蛋白质合成增加，为应对应激提供各种相关功能蛋白。

第三级应激反应是在次级应激反应的基础上，要么机体对应激源产生了适应性，各项生物学功能恢复正常，要么因应激损伤，个体或群体出现诸如生长速率、繁殖能力及抗病能力降低等变化[8]。研究应激对机体生理机能的损伤是揭示应激对动物健康影响的重要基础。由于应激能使机体内氧自由基增多[14]，过多的氧自由基能攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，造成脂质过氧化，脂质过氧化物进一步分解，可产生大量的醛类、醇类和烃类，其中MDA是具有很强生物毒性的物质，会对机体造成伤害[15]。而机体抗氧化系统的T-AOC、CAT等酶能清除自由基，减少脂质过氧化损伤[16]。本研究对高温应激下克氏原螯虾肝胰腺的T-AOC、CAT和MDA进行了测定，MDA的浓度随着应激时间的延长而持续增加，并于24 h达到最高，表明高温应激引起的脂质过氧化损伤在持续增加，同时T-AOC和CAT的含量在高温应激后也快速增加，并在应激24 h时仍然高于应激前水平，表明机体的抗氧化系统也在持续工作，使得MDA在高温应激24 h后迅速降低。

HSP70是机体在应激状态下细胞内合成的一种蛋白质，它能清除应激所造成的细胞内异常或变性蛋白质，同时具有活化其他基因的作用，广泛参与各种保护机体和细胞的功能[17-18]。本研究的结果显示，HSP70基因在正常情况下(应激前)在细胞中的表达水平低至无法检出，但在高温应激后3 h即可被检出，在35 ℃的高温应激下，其表达水平在6 h达到最高并持续到12 h，随后24 h降低至无法检出；而30 ℃下，HSP70基因只在应激后3 h出现少量表达，随后到6 h后降低至无法检出。这表明30 ℃和35 ℃均能引起机体发生应激反应，诱导HSP70基因的转录表达，且35 ℃的应激强度比30 ℃强，持续的时间更长。

综上所述，30 ℃和35 ℃高温均能引起克氏原螯虾机体发生应激反应，随着应激时间的延长，机体从基因水平、内分泌水平以及生理生化水平全方位地协调应对和消除应激的不良影响，使机体免于应激损伤。在池塘养殖上，控制养殖水温是不现实的，那么如何人工干预和消除高温应激，提高克氏原螯虾的抗应激能力，尚需进一步探讨和研究。

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PhysiologicalresponsesofProcambarusclarkiitohightemperaturestress

XU Jin,WEI Kai-jin,XU Bin,MA Bao-shan,ZHU Xiang-yun

(YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina,Wuhan430223，China)

This study was conducted to investigate the effects of high temperature on the biochemistry index,antioxidant activity and theHSP70 gene expression of the Red Swamp CrawfishProcambarusclarkii.The high temperature stress (HTS) experiment was carried out at the temperature of 30 and 35 ℃ respectively.The hemolymph and hepatopancreas were sampled before stress and at 3,6,12,24,48 h post-temperature stress (PTS) which were used for the analyses of lactate dehydrogenase (LD),glucose (GLU),total cholesterol (TCHO),total protein (TP),triglyceride (TG) and total antioxidant capacity (T-AOC),catalase (CAT),malondialdehyde (MDA),heat shock protein 70 (HSP70) gene expression respectively.The results showed that,at the primary stage of HTS (at 6 h PTS),the TCHO and LD concentration of the hemolymph were increased sharply.The concentration of GLU was continuously increased at 24 h PTS.TG had no significant change at the primary stage of HTS but increased sharply at 6 h PTS and reached the highest level at 12 h PTS and then dropped down.TP reduced at the primary stage of HTS and then recovered to the normal level at 12 h PTS.The concentration of MDA in the hepatopancreas was continuously increased post stress and reached the highest level at 24 h PTS,then dropped to the normal level at 48 h PTS.The T-AOC of the hepatopancreas was increased to the highest level at 3 h PTS and then dropped down,and the CAT was increased to the highest level at 6 h and 12 h respectively and then dropped down to the normal level.TheHSP70 mRNA could not be detected before HTS but could be detected at 3 h PTS,and huge expression was detected began at 6 h to 12 h PTS in the 35 ℃ group，while it could not be detected after 6 h PTS in the 30 ℃ group.This study revealed that high temperatures of 30 and 35 ℃ could cause stress and affect the body′s physiological functions ofProcambarus.clarkia.

Red Swamp CrawfishProcambarusclarkia;high temperature stress;biochemistry index;antioxidant activity;HSP70

2017-09-09；

2017-09-10

中国水产科学研究院基本科研业务费资助(2016HY-ZC02)

徐 进(1982- )，博士，副研究员，主要从事水产养殖疾病学研究。E-mail：xujin@yfi.ac.cn

魏开金。E-mail：weikj@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0009-05