荔枝酒低温高糖发酵技术研究

张 斌，李明阳

(惠州学院生命科学学院，广东惠州516007)

荔枝酒低温高糖发酵技术研究

张 斌，李明阳

(惠州学院生命科学学院，广东惠州516007)

为了解决高糖发酵迟缓和不彻底的问题，通过添加氮源强化发酵能力，考察了添加氮源对果酒中总糖、酒精度、总酯和杂醇油等的影响。结果显示，添加氮源可以明显促进发酵时对糖的消耗，提升乙醇和酯类物质得率，降低杂醇油生成量。与对照样相比，添加尿素、硫酸铵及复合氮源发酵的酒样总糖浓度分别降低了22.63%、27.24%和35.21%；酒精含量分别提高了14.63%、20.42%和23.16%；杂醇油含量分别降低了4.70%、8.33%和14.41%。研究表明，添加氮源可以促进荔枝酒的低温高糖发酵，有利于提升荔枝酒的品质。

荔枝酒； 高糖发酵； 氮源

高糖发酵（含糖量≥25%）因具有设备利用率高、效率高和节约能源等优点而被广为应用。在酒精发酵初期，高糖度会引起高渗透压，高渗透压会影响酵母的生长代谢，同时随着酒精含量的增大，会削弱酵母细胞膜对极性分子的屏蔽能力，对细胞膜成分和细胞代谢产生影响，不同的酵母菌株对酒精的耐受性不同，酵母的生长代谢和发酵能力也取决于酒精耐受力的大小[1-2]。菌种生长和发酵产物合成需要氮源，氮源主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成。发酵中使用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐、氨水等。本实验研究了添加蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸铵等氮源强化果酒发酵能力，找到了最佳添加量，为荔枝酒的高糖发酵提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荔枝汁：由广东祯州集团有限公司提供；食品级蛋白胨、食品级尿素、食品级硫酸铵、食品级硝酸铵，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇均为色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

6890N气相色谱仪-5975质谱仪：美国Agilent公司；顶空固相微萃取装置(聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)萃取头100 μm)：美国Supelco公司；UV-7504紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高糖发酵工艺

荔枝汁→冷冻浓缩（总糖340 g/L)→成分调整（调酸）→接种酵母菌（250 mg/L）→添加氮源→酒精发酵（12℃）→过滤→陈酿→成品

1.3.2 气质联用分析果酒中杂醇油[3-4]

（1）顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)

在15 mL顶空样品瓶中添加10 mL酒样，在磁力搅拌器作用下以50℃平衡10 min，将微萃取纤维100 μm 的PDMS在250℃老化处理2 h，再以50℃顶空萃取40 min，再以230℃脱附3 min，待检。

（2）GC/MS操作条件

气相色谱条件：DB-1色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25µm)，柱温为程序升温：先以45℃保持1 min，再以3℃/min升温至55℃，保持1 min，再以10℃/min升温至120℃，保持10 min后再升温到200℃。进样口温度为230℃，载气为氦气(He)，流速1 mL/min，不分流。

质谱条件：电离方式电子电离(electronic ionization，EI)源，电子能量70 eV，检测器电压为350 V，离子源温度230℃，接口温度280℃，以35～335 amu为扫描质量范围。

（3）数据处理

以保留时间进行定性，外标峰面积法进行定量。

1.3.3 标准溶液的配制

准确称取甲醇20.0 mg、丙醇30.0 mg、正丁醇40.0 mg、异丁醇40.0 mg、异戊醇40.0 mg，用体积分数40%乙醇水溶液溶解并定容至10 mL，混匀，密封后置于冰箱中保存，使用时用体积分数40%乙醇水溶液稀释10倍。

1.3.4 理化指标测定方法

总糖和酒精度等常规理化指标测定采用国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，总酯测定方法参照国标GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 结果与分析

2.1 响应面优化分析

2.1.1 单一氮源

分别添加蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸铵等单一氮源，发酵结束后总糖与氮源添加浓度的关系见图1。

图1 氮源对总糖的影响

由图1可看出，添加不同氮源的酒样，发酵过程中总糖变化趋势不同。氮源添加浓度在300～800 mg/L时，单一添加蛋白胨、尿素和硫酸铵的酒样，总糖浓度均呈现先降低后上升的趋势，且分别在400 mg/L、500 mg/L和700 mg/L添加量时，总糖浓度最低；单一添加硝酸铵的酒样，总糖浓度随着添加量的增加而呈现出上升趋势。蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵的最优添加量分别为400 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、300 mg/L，其相对空白样的变化见图2。

图2 发酵过程中总糖的变化

由图2可知，所有酒样的总糖含量均随发酵时间呈现明显降低的趋势。添加了氮源酒样的发酵速率均比对照样高，说明外氮源促进了高糖发酵的进行。随着发酵的进行，总糖含量下降的速率逐渐降低，这是由于伴随着高糖发酵的进行，酒样中酒精含量不断增加，较高的酒精含量削弱了酵母细胞膜对极性分子的屏蔽能力，对细胞膜成分和细胞代谢过程产生影响，从而使发酵效率逐渐降低。4种氮源对高糖发酵的促进效果由强到弱的顺序分别为硫酸铵＞尿素＞硝酸铵＞蛋白胨。

2.1.2 响应面法优化复合氮源

以酒精度作为参考指标，选择硫酸铵和尿素进行最陡爬坡实验。最陡爬坡实验设计与结果见表1。

表1 最陡爬坡实验设计与结果

由表1可知，在第3组氮源添加组合条件下，发酵结束后的酒精度最高。因此，以第3组实验的氮源添加条件作为响应面设计的中心点，以发酵结束后的酒精度为响应值，进行2因素5水平的Central-Composite设计，各因素水平见表2。Central-Composite设计及实验结果见表3。

表2 Central-Composite设计各因素水平

表3 Central-Composite设计及实验结果

用Design Expert软件对表3中酒精度数据进行回归分析，得到以发酵结束后酒精度为响应值的线性回归方程为：

其中响应值Y为发酵结束后的酒精度，X1为尿素添加量，X2为硫酸铵添加量，根据回归分析结果与回归方程进行回归模型及系数显著性检验和回归模型方差分析，结果见表4和表5。

由表4、表5可知，回归模型的F值为30.80，Prob(P)＞F的概率仅为0.0009，并且，模型的相关性系数R2=0.9686，这说明该模型的拟合性较好且该模型显著性较高。因此，可以用该模型进行分析和预测添加氮源强化高糖发酵后的酒精度。用Design Expert软件绘制出两种氮源之间交互影响的响应面分析三维曲面图和等高线图，见图3和图4。

由响应面分析可知，两因素间的相互作用比较明显。软件推荐的通过响应面优化得出的最优氮源添加组合及添加量为：尿素445 mg/L、硫酸铵650 mg/L，发酵结束后酒精度理论值为14.36%vol。

2.2 优化后的高糖发酵

以响应面优化得到的最优氮源添加条件进行高糖发酵，将优化后的发酵实验数据与空白样及单一氮源添加进行对比分析。

表4 回归模型及系数显著性检验

表5 回归模型方差分析

2.2.1 对总糖和酒精度的影响

图3 响应面分析三维曲面图

图4 响应面分析等高线图

发酵过程中总糖含量和酒精度变化分别见图5和图6。

图5 总糖随发酵时间的变化

图6 氮源对酒精度的影响

由图5和图6可知，所有发酵果汁的总糖浓度均呈现快速降低的趋势，发酵液的酒精含量均呈现快速升高的趋势。添加了氮源的发酵效率明显高于未添加氮源的对照样，复合氮源的发酵效率明显高于单一氮源。相对于空白样，单一氮源的酒样，发酵结束后总糖浓度分别降低了22.63%和27.24%，酒精含量分别增加了14.63%和20.42%；复合氮源的酒样，总糖浓度降低了35.21%，酒精含量增加了23.16%。复合氮源比单一氮源的酒样发酵结束后总糖分别降低了16.35%和10.93%，酒精度分别增加了7.82%和2.65%。

经响应面分析后酒精度的实际含量是预测含量的97.38%，这说明经响应面分析所得到的模型可以较好的预测实际发酵情况。

2.2.2 对总酯的影响

发酵过程中的总酯含量变化见图7。

由图7可知，随着发酵的进行，各酒样总酯含量均呈现上升趋势。添加氮源调控的高糖发酵的酒样总酯含量均高于对照样。与对照样相比，添加尿素、硫酸铵及复合氮源发酵的酒样总酯含量分别增加了15.85%、19.58%、24.94%。由此可见，经响应面优化后所得的总酯含量高于单一氮源。

总酯是果酒中所有酯类芳香物质的总和，是果酒中主要香气成分的重要组成之一。总酯含量的高低在一定程度上决定了果酒品质的好坏。在高糖发酵过程中，酯类物质的产生与酵母细胞的代谢过程有关。酵母细胞经分解代谢将糖类分解成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A的分解和来源于氨基酸的碳骨架构成了酯类物质合成的主要原料。在高糖发酵时添加了氮源后，对谷氨酸和亮氨酸等氨基酸的合成具有积极的促进作用，从而促进了高糖发酵荔枝酒中总酯的生成。例如，在酵母细胞利用亮氨酸合成乙酸异戊酯的过程中，亮氨酸经过脱氨和脱羧产生一种醛，然后生产的醛被还原成醇，最后生成的醇可以与乙酰辅酶A发生酯化反应从而生成乙酸异戊酯[5-7]。

2.2.3 对杂醇油的影响

杂醇油是果酒中重要芳香物质的组成成分之一，是正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等高级醇类的统称。适量的杂醇油可以使酒体更加醇厚饱满，但过量就会影响酒的品质。因为杂醇油在人体中的代谢速度较慢，停留时间长，对人体有一定的毒害作用，能使神经系统充血，从而使人感到头痛头晕[8-10]。在高糖发酵过程中杂醇油含量变化见图8。

图8 氮源对杂醇油的影响

由图8可知，在高糖发酵过程中，各酒样的杂醇油含量均呈现上升趋势。与对照样相比，添加尿素、硫酸铵及复合氮源发酵酒样的杂醇油含量分别降低了4.70%、8.33%和14.41%。可见，添加氮源对杂醇油的产生具有一定的抑制作用，响应面优化组的抑制效果最好，其次是硫酸铵。

在果酒发酵的过程中，杂醇油的来源有两条途径：一是降解代谢途径，在此途径中杂醇油的形成是由氨基酸转氨、脱羧、还原而产生；二是合成代谢途径，在该途径中杂醇油是由糖类经生物合成氨基酸的中间阶段形成α-酮酸中间体后经脱羧、还原从而形成高级醇。当发酵过程中的氮源不足时，酵母细胞就会经过代谢途径，以氨基酸作为氮源，从而增加了杂醇油的含量[11-15]。当添加了氮源补充发酵氮源后，就会减少这部分高级醇的产生机会，从而降低了果酒中杂醇油含量。

3 结论

荔枝酒在12℃左右低温高糖发酵时，添加单一硫酸铵、尿素、硝酸铵和蛋白胨等氮源均能促进发酵，硫酸铵和尿素复合添加的最优添加量分别为650 mg/L和445 mg/L。外加氮源有利于提升乙醇和酯类物质得率，降低高级醇生成量，使酒体香气浓郁，提升荔枝酒的品质。

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High-Sugar Low-Temperature Fermentation of Litchi Wine

ZHANG Bin and LI Mingyang

(School of Life Science,Huizhou University,Huizhou,Guangdong 516007,China)

In order to settle the problem of sluggish and unthorough high-sugar fermentation,nitrogen source was added for strengthening the fermenting power.The effects of adding nitrogen source on total sugar content,alcohol content,total esters content and fusel oil content in litchi wine were investigated.The results revealed that the addition of nitrogen source could evidently advance sugar consumption in fermentation process,enhance the yield of ethanol and esters,and reduce the yield of fusel oil.Compared with the contrast samples,in wine samples with the addition of urea,ammonium sulfate,and complex nitrogen source respectively,total sugar content reduced by 22.63%,27.24%,and 35.21%respectively,alcohol content increased by 14.63%,20.42%,and 23.16%respectively,and fusel oil content decreased by 4.70%,8.33%,and 14.41%respectively.All the evidence proved that adding nitrogen source was helpful for high-sugar low-temperature fermentation and for the improvement of litchi wine quality.

litchi wine;high-sugar fermentation;nitrogen source

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）11-0051-06

10.13746/j.njkj.2017203

广东省教育厅项目基金(2015KTSCX133)；惠州市科技项目基金（2015B010002001）。

2017-07-21

张斌（1979-），男，讲师，博士，主要从事果酒、葡萄酒酿造和食品绿色加工，E-mail：zhangbinwr@qq.com。

优先数字出版时间：2017-09-20；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170920.1451.003.html。