复方中药黄酮类成分提取工艺优化及抑制黑素合成活性研究

杜卓，李丽，董银卯，杜一杰

(北京工商大学，北京 100048)

·中药工业·

复方中药黄酮类成分提取工艺优化及抑制黑素合成活性研究

杜卓，李丽，董银卯*，杜一杰

(北京工商大学，北京 100048)

目的以总黄酮为指标，对由当归、丹参、黄芪、黄芩、甘草、白薇六味中草药形成的组方进行提取工艺优化，并通过体外检测对经过UVB刺激后B16黑素瘤细胞黑素合成抑制活性，探究组方提取物美白功能。方法采用CCK8法检测样品对B16细胞的增殖抑制活性，用NaOH裂解法测定黑素含量，用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量，以总黄酮为指标，考察提取时间、提取温度、料液比、溶剂4个主要因素，通过单因素和正交试验，研究组方最佳提取工艺。结果组方最佳提取工艺为提取时间3 h，提取温度85 ℃，提取料液比1∶20，提取溶剂75%乙醇。通过最佳提取工艺提取所得的组方提取物，对经过UVB刺激后的B16黑素瘤细胞黑素合成均具有显著抑制活性(P<0.01)，且呈剂量依赖型。结论采用最佳提取工艺提取的组方提取率高，具有较佳的美白活性，能为复方美白功能添加剂的开发提供参考。

中草药组方；B16黑素瘤细胞；黑素含量；总黄酮；美白

皮肤白皙一直是东方女性所追求的热点，故美白剂的开发也随之成为化妆品行业关注的焦点[1]。目前市场上的美白剂主要为烟酰胺、熊果苷、曲酸等。文献表明，这些物质虽然具有较好的美白功能，但存在一定的安全隐患，如烟酰胺、曲酸等被报道均具有一定的皮肤刺激性[1-2]。利用中草药提取物作为化妆品功能添加剂具有药效持久稳定、毒副作用小的优势，深受人们的青睐[3]。复方中草药通过诸多药合理配伍后，能发挥相辅相成的协同作用，使中草药功能得到充分发挥[4]，这成为国内外化妆品活性原料开发的主要趋势。研究表明，中草药中广泛存在的黄酮类化合物具有清除皮肤中自由基、抗炎、抑制酪氨酸酶，减少色素沉着等作用[5-6]，具有良好的美白活性。文献报道，黑色素的形成和沉积是影响肤色的决定因素[7]，故体外检测样品对B16黑素瘤细胞黑素合成抑制作用被广泛用于美白功能评价。

本研究以由当归、丹参、黄芪、黄芩、甘草、白薇六味中草药组成的复方为研究对象，以其主要美白成分总黄酮含量为指标，考察提取时间、提取温度、料液比、溶剂4个主要因素，通过单因素和正交试验，对组方最佳提取工艺进行优化，并通过体外检测其对经UVB刺激后的B16黑素瘤细胞黑素合成的抑制活性，探讨其美白功能，以期为复方美白功能添加剂的开发提供参考。

1 试剂和仪器

复方中草药(按照质量比1∶1∶1∶1∶1∶1秤取甘草、白薇、丹参、黄芪、当归、黄芩6味中药共250 g)；甘草GlycyrrhizauralensisFisch.产地内蒙古，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定；白薇RadixCynanchiAtrati.产地辽宁，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定；丹参SalviamiltiorrhizaBunge.产地四川，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定；黄芪stragalusmembranaceusFisch.Bunge.产地内蒙古，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定；当归RadixAngelicaeSinensis.产地甘肃，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定；黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi.产地内蒙古，北京东方淼森生物科技有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所许利嘉鉴定。

黑素瘤细胞(B16)(协和细胞库，批号150203)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号150209)；DMEM培养基(gibco，批号8115216)；胰蛋白酶(gibco，批号1676922)；双抗混合液(gibco，批号1697547)；PBS缓冲液(HyClone，批号NAH1449)；CCK-8试剂盒(同仁化学研究所，批号GW769)；芦丁(北京百灵威科技有限公司，批号L330P88)。

酶标仪(TACAN，M200pro)；真空冷冻干燥机(Virtis)；UVB灯、UVB311灯、KN-4006B(科诺)。

2 方法

2.1 组方提取工艺优化

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取时间 精密称取6份5.0 g组方，按1∶30的料液比加入150 mL 75%乙醇，在85 ℃下，分别提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，过滤得样品溶液，测定总黄酮含量。

2.1.1.2 提取温度 精密称取5份5.0 g组方，按1∶30的料液比加入150 mL 75%乙醇，分别在55、65、75、85、100 ℃，提取1.0 h，过滤得样品溶液，测定总黄酮含量。

2.1.1.3 提取料液比 精密称取5份5.0 g组方，分别按照1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，加入75%乙醇，在85 ℃下，提取1.0 h，过滤得样品溶液，测定总黄酮含量。

2.1.1.4 提取溶剂 精密称取5份5.0 g组方，按照1∶30料液比加入150 mL水95%乙醇、75%乙醇、60%乙醇、30%乙醇，在85 ℃下，分别提取1.0 h，过滤得样品溶液，测定总黄酮含量。

2.1.2 正交试验 精密称取9份10.0 g组方，以提取时间、提取温度、料液比、溶剂为考察因素，每个因素设3个水平，按L9(34)正交设计表进行试验，并以总黄酮含量为评价指标对组方提取工艺进行优化。

2.1.3 硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量 标准曲线制作[8]：芦丁于105 ℃下干燥至质量恒定，准确称取芦丁对照品10.0 mg，用30%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得质量浓度为100 μg·mL-1的芦丁标准母液。精密量取芦丁标准母液1、2、3、5、6、8 mL分别置于10 mL容量瓶中，分别加入30%乙醇溶液定容，得到质量浓度为10、20、30、50、60、80 μg·mL-1的芦丁标准液。再于5 mL EP管中分别加入芦丁标准液0.50 mL，30%乙醇3.22 mL，5%亚硝酸钠溶液0.14 mL，混匀，静置5 min，加10%硝酸铝0.14 mL，混匀，静置6 min；加1 mol·L-1NaOH溶液1.00 mL，混匀，静置10 min，以30%乙醇为空白对照，在510 nm处测定吸光值，以测得的吸光值(X)为横坐标，以对照品芦丁的浓度(Y)为纵坐标，得回归方程：Y=132.3X-0.164 3，相关系数r=0.999 1，表明样品溶液在0～80 μg·mL-1具有良好的线性关系。

样品总黄酮含量测定：将2.1.1和2.1.2制得的样品溶液用30%乙醇稀释10倍后，按上述方法测定总黄酮含量。

(1)

(2)

2.2 最佳UVB辐射剂量的筛选

2.2.1 CCK8法检测不同剂量UVB对B16黑素细胞的毒性 本研究采用UVB作为外界刺激源，刺激B16细胞黑素合成上调。

将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬浮液，待细胞贴壁后，吸出各孔的培养基，每孔加100 μL PBS缓冲液覆盖底面，用10种不同剂量UVB(150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2)辐射细胞，每个处理10个复孔，空白对照不使用UVB辐射。辐射完成后，用新鲜培养基替换PBS缓冲液继续孵育48 h，再加入CCK8试剂10 μL反应2 h后，酶标仪405 nm测定其吸光度。

(3)

UVB辐射细胞的具体条件如下：1)使用的科诺KN-4006B紫外线光疗仪含两根UVB紫外荧光灯(冷光源)，光谱范围为280～320 nm，发射峰为311 nm，辐照强度固定为10 mW·cm-2，有效辐射面积为(104±2%)cm2；UVB剂量计算：UVB辐照剂量(mJ·cm-2)=UVB辐照强度(mW·cm-2)×时间(s)；3)照射细胞前开机预热5 min，待UVB辐射度稳定后开始对细胞进行紫外辐射。UVB辐射细胞时，用UVB灯照射细胞，紫外光源距细胞10 cm，垂直照射，分别照射15、30、45、60、75、90、105、120、135、150 s，即UVB辐射剂量分别为150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2。

2.2.2 NaOH法检测不同剂量UVB对B16黑素细胞黑素合成的促进作用 将细胞以3×105的密度接种于60 mm细胞培养板中，待铺板的细胞贴壁后，吸出平皿中的培养基，并向每个平皿中加入1 mL PBS缓冲液覆盖底面，用10种不同剂量的UVB(150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2)辐射细胞，每个处理设置三个平行，空白对照不进行UVB辐射处理。UVB辐射的具体条件如上2.2.1所述。辐射结束后，用新鲜培养基替换PBS缓冲液，继续孵育48 h。孵育48 h后，用0.25%胰酶消化收集细胞，离心后PBS洗涤1次，加入1 mol·L-1NaOH(10%DMSO)200 μL，吹打数次，放入100 ℃的环境下沸腾10 min，使细胞溶解，取上清液加入96孔板，每孔200 μL，于450 nm读取吸光度值，并计算黑素合成抑制率[9]。

(4)

2.3 组方对经UVB刺激后的B16黑素瘤细胞黑素合成抑制活性

2.3.1 CCK8法检测组方对B16黑素瘤细胞的增殖抑制作用 用得到的最佳提取工艺提取组方，70 ℃旋蒸浓缩后，冷冻干燥制得组方提取物冻干粉。称取组方提取物冻干粉16 mg，溶解于2 mL的DMSO中，制备成8 mg·mL-1的样品母液。再分别用培养基将样品母液梯度稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1。

将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬浮液，待细胞贴壁后，吸出废旧培养基，用PBS清洗，再分别加入8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 3 mg·mL-1样品溶液，对照组用培养基代替，每个处理设置3个平行。孵育48 h，加入CCK8试剂10 μL反应2 h，酶标仪405 nm测定其吸光度，计算细胞的存活率。

(5)

2.3.2 NaOH法检测组方对B16黑素瘤细胞黑素合成抑制作用 样品溶液的配制：称取6 mg的组方提取物冻干粉，溶解于12 mL的DMSO中配制成500 μg·mL-1的样品母液，再用培养基将样品母液进行梯度稀释，制成250、125、62.5、31.3 μg·mL-14个浓度。

阳性对照溶液的配制：称取3 mg熊果苷粉末，溶于6 mL培养基中，即得500 μg·mL-1的熊果苷溶液。

实验操作过程：1)将细胞以3×105的密度接种于60 mm细胞培养板中并随机分为三组：空白对照组、样品组、阳性对照组；2)待细胞贴壁后，吸出培养液，加入1 mL PBS缓冲液覆盖平皿表面；3)用1050 mJ·cm-2UVB辐射细胞；4)辐射结束后，吸出PBS缓冲液，空白对照组加入5 mL新鲜培养基，样品组加入5 mL含样品培养基，阳性对照组加入5 mL含阳性对照培养基；5)继续孵育48 h后用NaOH裂解法检测黑素含量。实验方法如上2.2.2所述。

(6)

2.4 统计分析

实验中每个处理至少设置三组平行，取平均值，使用EXCEL软件计算处理，所测数据以(平均值±标准差)表示。使用SPSS 17.0软件进行组间显著性差异分析。

3 结果

3.1 组方提取工艺的优化

3.1.1 单个因素对组方总黄酮含量的影响

3.1.1.1 不同提取时间对组方总黄酮含量的影响 按照2.1.3所述方法，按照测定2.1.1.1不同提取时间所得的样品溶液中的黄酮含量，每个样品设置3个平行，结果见图1。

图1 不同提取时间对组方总黄酮含量的影响(n=3)

图1表明，随着提取时间增加，组方提取物中的总黄酮含量先增加后减少，在提取时间为3 h时达到最大值，故选取3 h为最佳提取时间。

3.1.1.2 不同提取温度对组方总黄酮含量的影响 按照2.1.3所述方法，按照测定2.1.1.2不同提取温度所得的样品溶液中的黄酮含量，每个样品设置3个平行，结果见图2。

图2 不同提取温度对组方总黄酮含量的影响(n=3)

图2表明，随着提取温度的增加，组方提取物中的总黄酮含量先增加后减少，在提取温度为75 ℃时达到最大值，故选取75 ℃为最佳提取温度。

3.1.1.3 不同提取料液比对组方总黄酮含量的影响 按照2.1.3所述方法，按照测定2.1.1.3不同提取料液比所得的样品溶液中的黄酮含量，每个样品设置3个平行，结果见图3。

图3 不同料液比对组方总黄酮含量的影响(n=3)

图3表明，随着提取料液比的增加，组方提取物中的总黄酮含量先增加后减少，在料液比为1∶30时达到最大值，故选取1∶30为最佳提取料液比。

3.1.1.4 不同提取溶剂对组方总黄酮含量的影响 按照2.1.3所述方法，按照测定2.1.1.4不同提取溶剂所得的样品溶液中的黄酮含量，每个样品设置3个平行，结果见图4。

图4 不同提取溶剂对组方总黄酮含量的影响(n=3)

图4表明，随着提取溶剂中乙醇含量的增加，组方提取物中的总黄酮含量先增加后减少，在提取溶剂为75%乙醇时达到最大值，故选取75%乙醇为最佳提取溶剂。

3.1.2 最佳提取工艺的优化 在单因素试验的基础上，按照2.1.2所述，选择L9(34)正交表，对提取时间、提取温度、提取料液比、提取溶剂4因素进行正交试验，以总黄酮含量为评价指标，对组方提取工艺进行优化，结果见表1。

表1表明，4因素中提取时间对组方总黄酮含量影响最大，各因素对总黄酮含量的影响主次顺序依次为提取时间>提取溶剂>提取温度>料液比。分析正交试验结果，确定组方最佳提取工艺为提取时间3 h，提取温度85 ℃，提取料液比1∶20，提取溶剂75%乙醇。

3.2 最佳UVB辐射剂量的筛选

按照2.2.1和2.2.2的方法，测定不同剂量UVB对B16细胞的增殖抑制活性和黑素合成促进作用。结果见表2～3。由表2可知，UVB对B16细胞增殖的影响随剂量增加起到先促进后抑制的作用，其中在UVB辐射剂量为1050 mJ·cm-2时，B16细胞活性达到最高。

表1 正交试验结果

表2 不同剂量UVB对B16细胞毒性作用(n=10)

表3 不同剂量UVB对B16细胞黑素合成作用(n=3)

由表3可知，随剂量的增加，UVB对B16细胞黑素合成起到不同程度的促进作用，其中在UVB辐射剂量为1050 mJ·cm-2时，对B16细胞黑素合成促进效果最明显。综合比较，选择1050 mJ·cm-2为刺激B16细胞黑素合成上调的UVB最佳辐射剂量。

3.3 组方对经UVB刺激后的黑素瘤细胞黑素合成抑制活性

3.3.1 组方对B16黑素瘤细胞的增殖抑制活性 按照2.3.1的方法测定组方提取物在8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5 μg·mL-1浓度下对B16黑素瘤细胞的增殖抑制活性，每组处理3个复孔。结果见表4。我们规定样品作用于B16黑素瘤细胞后，细胞存活率≥80%时，则认定该样品对细胞无毒。

由表4可知，组方提取物对B16细胞无毒的最大浓度为250 μg·mL-1。

3.3.2 组方对B16黑素瘤细胞黑素合成抑制活性 在组方无毒浓度范围内，选取250、125、62.5、31.3 μg·mL-14个浓度，按照2.3.2的方法检测组方提取物对B16细胞黑素合成的抑制作用。以500 μg·mL-1熊果苷溶液作为阳性对照，结果见表5。

表4 组方提取物对B16细胞毒性作用(n=3)

表5 组方及阳性对照对B16细胞黑素合成的抑制率(%)(n=3)

由表5可知，按最优提取工艺提取的组方，对经过UVB刺激后的B16细胞黑素合成具显著抑制效果(P<0.01)，并呈一定剂量依赖性。

4 讨论

黄酮类物质存在于大多数中草药中，具有多种生物活性。Badria F A等[10]研究表明，27种测试黄酮类化合物中有6种能显著抑制酪氨酸酶活性，具有抑制黑素合成的美白功能。目前，国内外对植物中黄酮类物质的提取工艺研究比较成熟，提取方法也很多，例如水提法、有机溶剂提取法、热回流提取法、微波辅助提取法、生物酶提取法等，其中以用乙醇溶液为提取溶剂的热回流提取法最为常见。

本研究通过单因素和正交试验，以总黄酮得率为指标，考察提取时间、提取温度、料液比、提取溶剂4个因素，对由甘草、白薇、丹参、当归、黄芪、黄芩六味药组成的复方提取工艺进行优化，并对组方提取物黑素合成抑制活性进行研究。结果表明，随着单因素的依次优化，最优条件逐渐增多，提取出的总黄酮量也逐渐增大，各因素对组方总黄酮得率的影响顺序依次为提取时间>提取溶剂>提取温度>料液比，最终优化的组方总黄酮提取工艺：提取时间为3 h、提取温度为85 ℃、提取料液比为1∶20、提取溶剂为75%乙醇。通过最优提取工艺，1 g组方生药能提取出16.84 mg黄酮类物质，所得的组方提取物对经过UVB刺激后的B16黑素瘤细胞黑素合成具有显著抑制活性(P<0.01)，且呈剂量依赖型。由此可见，采用最佳提取工艺提取的组方，提取率高，具有较佳的美白活性，能对复方美白功能添加剂的开发提供参考。

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StudyonExtractiveTechnologyofTotalFlavonesfromCompoundChineseHerbalMedicineandItsInhibitoryEffectonMelaninSynthesis

DU Zhuo，LI Li，DONG Yinmao*，DU Yijie

(BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Objective：The extraction process of Compound Chinese herbal medicine which contains Radix Astragali，Radix Scutellariae，Radix Angelicae Sinensis，Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix et Rhizoma Glycyrrhizae and Radix Cynanchi Atrati was optimized with the content of total flavonoids as index.And through theinvitrodetection of the inhibitory activities on the melanogenesis of B16 melanoma cells after UVB stimulation，the whitening effect of component herbs extracts was studied.MethodsThe cell proliferation inhibitory activity was detected by cck8 assay，the melanin content was detected by NaOH assay，the content of total flavonoids was detected by colorimetry with Al(NO3)3-NaNO2，with the content of total flavonoids as index the four major factors of extraction time，extraction temperature，solid-liquid ratio and extraction solvent were investigated.With single factor and orthogonal experiments，the best extraction process of the prescription was explored.ResultsThe best extraction process of prescription was as follows：extraction time 3 h；extraction temperature 85 ℃；extracting solid-liquid ratio 1∶20；extraction solvent 75% ethanol.And the prescription extracts showed a significant inhibitory activity(P<0.01)on the melanogenesis of B16 melanoma cells after UVB stimulation in dose-dependent manner.ConclusionThe prescription extracts through the best extraction process has high extraction efficiency and high skin-whitening activity，which can provide a reference for the development of compound whitening efficacy additive.

Compound Chinese herbal medicine；B16 melanoma cells；melanin content；total flavonoids；skin-whitening

*

董银卯，教授，研究方向：化妆品植物功效原料与配方技术；E-mail：ymdong2008@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.020

2016-12-19)