同时检测动物性食品中6 种β—受体激动剂的化学发光免疫分析方法的建立

王建军+熊雅婷+秦誉+杨恒峰+张鹏坤

摘 要：建立同时测定动物性食品中6 种β-受体激动剂（克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗）残留的化学发光免疫分析方法。结果表明：6 种β-受体激动剂在猪肉样品中的检测限（limit of detection，LOD）分别为0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉样品中的LOD分别为0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg；样本的平均添加回收率为66.7%～106.4%，且批内、批间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%。在最优条件下，西马特罗的50%抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为0.254 μg/L，克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗与西马特罗的交叉反应率分别为438.0%、470.0%、434.0%、561.0%和198.0%。同时，比较化学发光免疫分析方法和液相色谱-串联质谱（liquid chromatographic-tandem mass spectrometric，LC-MS/MS）法的检测结果，表明化学发光免疫分析方法具有较高的准确度和可靠性。因此，化学发光免疫分析方法能够实现动物性食品中多种β-受体激动剂药物残留的快速检测，且灵敏度较高。

关键词：化学发光免疫分析；动物性食品；β-受体激动剂

Simultaneous Determination of 6 β-agonists in Animal-Derived Food by Chemiluminescence Immunoassay

WANG Jianjun1， XIONG Yating2，*， QIN Yu2， YANG Hengfeng3， ZHANG Pengkun4

（1.Baoding Animal Products Quality Inspection and Monitoring Center， Baoding 071000， China； 2.Beijing WDWK Biotechnology Co. Ltd.， Beijing 100095， China； 3.Hezhou Municipal Bureau of Fishery and Veterinary Medicine， Hezhou 542800， China； 4.Fushun Animal Disease Prevention and Control Center， Fushun 113006， China）

Abstract： In this paper， a chemiluminescence immunoassay （CLIA） for simultaneously detecting 6 β-agonist drugs residues in animal-derived food was established. The limits of detection （LODs） for clenbuterol， cimaterol， bromobuterol， bambuterol， mabuterol and sibuterol in pork were 0.48， 1.96， 0.41， 0.29， 0.42 and 0.87 μg/kg， respectively， and in mutton were 0.37， 1.78， 0.43， 0.38， 0.31 and 0.96 μg/kg， respectively. Mean recoveries from spiked samples ranged from 66.7% to 106.4%， and the intra-assay and inter-assay relative standard deviation （RSD） values were less than 15%. The half maximal inhibitory concentration （IC50） of cimaterol was 0.254 μg/L under optimum conditions， and its cross-reaction rates with clenbuterol， bromobuterol， bambuterol， mabuterol and sibuterol were 438.0%， 470.0%， 434.0%， 561.0% and 198.0%， respectively. The developed immunoassay was more accurate and reliable than liquid chromatographic-tandem mass spectrometric

（LC-MS/MS）. Therefore， chemiluminescence immunoassay proved to be an effective analytical technique for monitoring β-agonist drug residues in animal-derived food owing to its high sensitivity.

Key words： chemiluminescence immunoassay； animal-derived food； β-agonist

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201710007

中圖分类号：S854.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）10-0036-05

β-受体激动剂能够增强心脏收缩、扩张骨骼肌血管和支气管平滑肌，在兽医和临床上用于治疗休克和支气管痉挛，对牛、羊、猪、家禽等多种动物具有提高饲料转化率和增加瘦肉率的作用[1-4]。然而，人类长期食用有β-受体激动剂残留的动物性食品会引起中毒症状，严重时可导致死亡[5-6]。因此，各国已明确禁止在食源性动物中使用β-受体激动剂类药物[7-9]，但是由于经济利益的驱使，目前在畜牧生产中使用β-受体激动剂药物的现象仍有发生，因而建立高灵敏度的β-受体激动剂检测方法对食品安全具有重要意义。

目前，β-受体激动剂的检测方法主要包括液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[10-11]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass

spectrometry，GC-MS）法[12]和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]。

LC-MS/MS仪和GC-MS仪的方法灵敏度高，常被作为定量确證方法，但是其设备昂贵、操作复杂、分析时间较长，无法满足现场大批量样本的检测需求。ELISA检测速度快、操作便捷，但是灵敏度和准确度仍有待提高，只能作为初筛手段，因此寻找快速、准确、高通量的检测方法是目前β-受体激动剂检测方法的研究趋势[15-16]。

化学发光免疫分析技术[17-20]是借助于化学发光反应的高灵敏性和免疫反应的高特异性而建立的一种测定方法，具有灵敏度高、特异性强、成本低、方法稳定、快速、检测范围宽、操作简单及自动化程度高等优点，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法。高灵敏度的化学发光检测技术已被研究人员认可，广泛应用于免疫分析、环境生物医药科学和临床化学等方面，成为药物残留检测发展的一种趋势[21-23]。

本研究基于化学发光免疫分析技术，建立同时检测猪肉、羊肉等动物性食品中6 种β-受体激动剂（克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗）残留的化学发光免疫分析方法，同时将检测结果与LC-MS/MS法[24]进行比较，验证方法的可行性，更好地满足我国食品企业和政府职能监管部门开展检测工作的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、羊肉 北京大型超市；6 种β-受体激动剂（克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗）标准品（纯度≥98%） 美国Sigma

公司；浓缩洗涤液（20 mmol/L的磷酸缓冲液）、鲁米诺发光底物液（纯度98%） 北京华迈科生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

BILON-WX08型高速电动匀浆机 上海比朗仪器制造有限公司；HQ-60型恒温振荡器 北京方正生物科技发展有限公司；TDL-40C型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；Thremo-F2型微量移液器 美国Thermo公司；Agilent 1200高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；Cobas E411型全自动化学发光免疫分析仪 北京维德维康生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半抗原的制备

称取半抗原原料（本实验室自主设计）500 mg，用5 mL叔丁胺溶解，搅拌，反应完全后旋转蒸干溶剂，进行柱层析纯化；用5 mL N，N-二甲基甲酰胺

（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解，在冰浴条件下加入90.6 mg NaH搅拌，加入396 μL 4-溴丁酸乙酯，40 ℃加热反应，反应完全后将溶液置于冰水中，析出沉淀用甲醇溶解后，加入1 mol/L的NaOH进行水解，调节pH值至6.0，将溶液旋转蒸发至干，收集固体，即得半抗原。

1.3.2 包被原溶液的制备

将11.01 mg半抗原用1.5 mL DMF溶解，加入21.5 mg 1-（3-二甲基胺丙基）-3-乙基碳二亚胺

（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide，EDC）溶解、活化。同时取牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）50 mg溶于3.5 mL 0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液，将上述半抗原混合溶液逐滴加至BSA混合溶液中，冰浴搅拌24 h，装入透析袋，在磷酸缓冲液中透析3 d，得到包被原溶液。

1.3.3 抗体工作液的制备

取10 mg BSA，用pH 7.4、0.02 mol/L PBS缓冲液溶解并定容至1 000 mL，得到抗体稀释液；将本实验室制备的多克隆抗体用抗体稀释液稀释至1.5×105 倍，得到多克隆抗体工作液（质量浓度为0.1 μg/mL）。

1.3.4 方法操作步骤

准确称取（1.00±0.01） g均质后的样品，加入3 mL 0.5%的三氯乙酸，高速涡旋、离心；取1 mL中间层清液，加入40 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液，充分混匀，制得样品溶液，待测。

向已包被抗原的化学发光微孔板中加入标准品溶液或待测样品溶液（50 μL/孔），再加入抗体工作液（50 μL/孔），室温反应20 min，弃去上清液，洗涤4 次，用吸水纸拍干，每孔加入100 μL新鲜配制的发光底物液（A液和B液等体积混合），用化学发光仪检测每孔的光子数。

1.3.5 标准曲线的绘制

在PBS缓冲液中加入β-受体激动剂标准品，使其质量浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L，用化学发光免疫分析仪进行检测。以β-受体激动剂标准品的质量浓度为横坐标，以百分光子计数强度为纵坐标，绘制6 种β-受体激动剂的标准曲线。每个样品均重复测定5 次，计算50%抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），以IC50值最大的物质为基准，绘制标准曲线。根据交叉反应率计算其他5 种药物的含量。

1.3.6 方法学评价

检测限（limit of detection，LOD）：以LOD作为灵敏度指标。取20 份猪肉和羊肉空白样本进行检测，并通过标准曲线得到β-受体激动剂的浓度，计算标准偏差，测定平均值+3 倍标准差即为该样本的LOD[25]。

准确度和精密度：选取猪肉和羊肉空白样本，分别添加克伦特罗、溴布特罗、班布特罗和马布特罗标准品，使其添加量分别为0.5、1.0 μg/kg；添加西马特罗标准品，使其添加量分别为2.0、4.0 μg/kg；添加西布特罗标准品，使其添加量分别为1.0、2.0 μg/kg。每个样品均重复测定10 次，连续测定3 d，计算平均添加回收率和批内、批间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

特异性：是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力，常用交叉反应率表示[26]。选择具有类似结构和功能的药物，本研究按照1.3.5节所述方法测定莱克多巴胺和齐帕特罗的IC50，以西马特罗的IC50为基准，按照下式计算各药物与西马特罗的交叉反應率。

1.3.7 样品测定

为评价化学发光免疫分析方法的准确性，将检测结果与采用LC-MS/MS测得的结果进行对比。

LC条件：C18色谱柱，流动相为0.1%甲酸-乙腈（95∶5，V/V），流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL。MS条件：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子模式（ESI+），温度150 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，脱溶剂气流速900 L/min，锥空气流速

50 L/min，毛细管电压2.8 kV，多反应监测（multiple reaction monitorin，MRM）。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 检测原理

本研究设计的半抗原结构最大限度地保留了6 种β-受体激动剂的共同免疫活性基团，检测时，待测样本溶液中的β-受体激动剂与化学发光板上的包被原竞争一抗，然后与酶标二抗进一步结合，加入鲁米诺化学发光底物液，发光强度与待测样本溶液中β-受体激动剂的含量呈负相关，根据标准曲线即可得出待测样本溶液中β-受体激动剂的残留量[27]。

2.2 标准曲线

6 种β-受体激动剂药物中，西马特罗的IC50最大，其标准曲线方程为y=-0.267 0lnx+0.732 9（R2=0.998 8），IC50=0.254 μg/L，线性范围为0.072～1.800 μg/L。

2.3 检测限

由表1可知，克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗在猪肉中的LOD分别为0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉中的LOD分别为0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg。

2.4 准确度和精密度

由表2可知，克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗在猪肉、羊肉样品中的平均添加回收率为66.7%～106.4%；批内、批间RSD均小于15%，说明化学发光免疫分析法的准确度和精密度良好。

2.5 交叉反应率

以西马特罗的IC50为基准计算交叉反应率，由表3可知，克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗、西布特罗均与西马特罗有较高的交叉反应率；莱克多巴胺、齐帕特罗与西马特罗的交叉反应率极低，说明本方法特异性强，符合检测需求。

2.6 2 种方法的对比

LC-MS/MS法的实际检测结果如图1所示。

LC-MS/MS法对克伦特罗、溴布特罗、马布特罗和西马特罗的LOD均为0.5 μg/kg[27-28]。由表4可知，

LC-MS/MS法检测得到具体β-受体激动剂药物的含量，其检出总量与化学发光免疫分析方法的结果基本一致。2 组检测结果进行差异显著性分析的结果表明，

P=0.558>0.05，说明2 种方法的检测结果无显著性差异，进一步证实了化学发光免疫分析法的测定准确性。此外，与LC-MS/MS法相比，化学发光免疫分析法操作便捷、准确度高，便于在现场大批量样本检测中推广。

3 讨 论

目前，关于动物性食品中β-受体激动剂高通量、多残留量的检测研究报道较少[28-30]，且检测药物单一。本研究通过人工合成抗原，基于化学发光免疫分析技术，同时检测猪肉和羊肉样品中6 种β-受体激动剂药物残留。结果表明，克伦特罗、西马特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗和西布特罗在猪肉样品中的LOD分别为0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉样品中的LOD分别为0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg，样本的平均添加回收率在66.7%～106.4%之间，批内、批间RSD均小于15%；交叉反应率计算结果表明本方法对

β-受体激动剂类药物的特异性良好。与王硕[31]、李细芬[32]

等的克伦特罗单一药物化学发光酶免疫分析方法相比，本研究覆盖的药物种类更全面。

本研究所建立化学发光免疫分析法的LOD、准确度和精密度均符合我国残留检测标准的规定，实际样品的检测结果与LC-MS/MS法无显著差异，进一步证实了本方法的实用性。且本方法操作步骤简单，可在30 min内实现样本检测，无需大量化学试剂，减少了人力、物力和财力的浪费，有效降低检测成本，适用于基层食品安全检测单位及肉制品加工生产企业进行日常监管工作。

综上所述，化学发光免疫分析技术能够用于快速同时检测动物源性食品中多种β-受体激动剂类药物的残留，且灵敏度高、成本较低、检测时间更短，具有良好的准确性和可靠性，能够为食品中兽药残留的高通量、快速检测提供有力的技术支持。

参考文献：

[1]赵文成. β-兴奋剂残留的分离检测研究[D]. 兰州： 甘肃政法学院， 2016： 23-31.

[2]杨菲， 王培龙， 石雷， 等. β-受体激动剂速测技术研究[J]. 农产品质量与安全， 2015（4）： 41-47. DOI：10.3969/j.issn.1674-8255.2015.04.010.

[3]高照， 張援， 张亦农， 等. 动物组织内残留β2-受体激动剂的检测方法研究进展[J]. 中国运动医学杂志， 2014， 33（4）： 370-378. DOI：10.3969/j.issn.1000-6710.2014.04.018.

[4]王培龙. β-受体激动剂及其检测技术研究[J]. 农产品质量与安全， 2014（1）： 44-52. DOI：10.3969/j.issn.1674-8255.2014.01.012.

[5]KOOTSTRA P R， KUIJPERS C J P F， WUBS K L， et al. The analysis of beta-agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LC-MS screening[J]. Analytica Chimica Acta， 2005， 529（1）： 75-81. DOI：10.1016/j.aca.2004.09.053.

[6]WANG Peilong， WANG Zhi， SU Xiaoou. A sensitive and quantitative fluorescent multi-component immuno-chromatographic sensor for β-agonist residues[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2015， 64（15）： 511-516. DOI：10.1016/j.bios.2014.09.064.

[7]GON?ALVES V C S， SANTOS K T J， ZUNIGA N O C， et al. Optimization of a multiresidue and multiclass analysis method for anabolic agents and β2-agonists in bovine urine by GC-MS/MS[J]. Microchemical Journal， 2017， 133（7）： 551-555. DOI：10.1016/j.microc.2017.03.033.

[8]JI Xinghu， HE Zhike， AI Xinping， et al. Determination of clenbuterol by capillary electrophoresis immunoassay with chemiluminescence detection[J]. Talanta， 2006， 70（2）： 353-357. DOI：10.1016/j.talanta.2006.02.053.

[9]陈效兰. 鲁米诺化学发光体系的增强研究及其相关应用[D]. 长沙： 中南大学， 2013： 13-15. DOI：10.7666/d.y2422626.

[10]王建平， 史为民， 沈建忠. 免疫亲和色谱-气相色谱/质谱法（IAC-GC/MS）

检测猪肝中的沙丁胺醇与克伦特罗[J]. 畜牧兽医学报， 2007， 38（3）： 271-275. DOI：10.3321/j.issn：0366-6964.2007.03.012.

[11]汪辉， 彭新凯， 王玉枝， 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定加工肉制品中莱克多巴胺及克伦特罗的含量[J]. 分析测试学报， 2012， 31（5）： 509-516. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2012.05.001.

[12]陶晓奇. 动物性食品中酰胺醇类残留化学发光检测技术研究[D].

北京： 中国农业大学， 2014： 28-33.

[13]张燕， 杨金易， 曾道平， 等. 化学发光免疫分析技术及其在食品安全检测中的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报， 2013， 31（5）： 1421-1427.

[14]肖勤， 林金明. 化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J]. 分析化学， 2015， 43（6）： 929-938. DOI：10.11895/j.issn.0253-3820.141135.

[15]韩鹤友， 游子涵， 李庆， 等. 化学发光联用技术在兽药残留分析中的应用进展[J]. 分析科学学报， 2005， 21（5）： 552-556.

[16]陈海斌. 化学发光免疫分析技术及其进展[J]. 中国医学装备， 2011， 8（5）： 56-59. DOI：10.3969/j.issn.1672-8270.2011.05.020.

[17]XIAO Yipo， LU Haiyan， L? Shaojun， et al. Rapid analysis of trace salbutamol and clenbuterol in pork samples by mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry， 2016， 44（11）： 1633-1638. DOI：10.1016/S1872-2040（16）60968-4.

[18]WANG Wenwen， SU Xiaoxiao， LIN Huiyang， et al. A novel immunochromatographic assay based on a time-resolved chemiluminescence strategy for the multiplexed detection of ractopamine and clenbuterol[J]. Analytica Chimica Acta， 2016， 917（3）： 79-84. DOI：10.1016/j.aca.2016.03.001.

[19]WU Yuping， XU Fei， JIANG Haiyang， et al. Determination of salbutamol， clenbuterol， and brombuterol in urine by a highly sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay[J]. Analytical Letters， 2014， 47（16）： 2761-2773. DOI：10.1080/00032719.2014.917422.

[20]XU Jingyue， LI Ying， GUO Jiajia， et al. Fluorescent detection of clenbuterol using fluorophore functionalized gold nanoparticles based on fluorescence resonance energy transfer[J]. Food Control， 2014， 46（12）： 67-74. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.05.002.

[21]RODA A， MANETTA A C， PIAZZA F， et al. A rapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol[J]. Talanta， 2008， 52（2）： 311-318. DOI：10.1016/S0039-9140（00）00362-3.

[22]HARKINS J D， WOODS W E， LEHNER A F. Clenbuterol in the horse： urinary concentrations determined by ELISA and GC/MS after clinical doses[J]. Pharmacology Therapeutics， 2001， 24（1）： 7-14. DOI：10.1046/j.1365-2885.2001.00300.x.

[23]JELKA P， IGOR B， ANA V， et al. Analysis of clenbuterol residues in pig liver using liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Reviews in Analytical Chemistry， 2011， 30（1）： 5-9. DOI：10.1515/revac.2011.008.

[24]中華人民共和国上海出入境检验检疫局， 上海市疾病预防控制中心， 上海水产大学， 等. GB/T 22286—2008 动物源性食品中多种

β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.

[25]王毅谦， 陆慧媛， 袁芳， 等. 竞争化学发光酶免疫测定技术检测盐酸克伦特罗[J]. 食品安全质量检测学报， 2016， 7（11）： 4518-4524.

[26]沈浩龙， 陈巧钦， 张长弓， 等. 莱克多巴胺的化学发光免疫测定法试剂盒的研究[J]. 中国动物检疫， 2014， 31（7）： 91-96. DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2014.07.029.

[27]POU K， ONG H， ADAM A， et al. Combined immunoextraction approach coupled to a chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of trace levels of salbutamol and clenbuterol in tissue samples[J]. The Analyst， 1994， 119（12）： 59-62. DOI：10.1039/an9941902659.

[28]王权， 赵新宇， 蒋蔚， 等. 检测猪尿、猪肉中莱克多巴胺的化学发光间接竞争免疫分析方法的建立[J]. 畜牧与兽医， 2013， 45（3）： 17-21.

[29]张瑞华， 李芳， 康怀彬， 等. 动物源性产品中盐酸克伦特罗检测方法的研究进展[J]. 食品研究与开发， 2017， 38（3）： 208-211. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.047.

[30]王硕， 李细芬， 生威， 等. 增强化学发光酶免疫法对猪肉中盐酸克伦特罗的检测[J]. 分析测试学报， 2010， 29（3）： 215-219. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2010.03.001.

[32]李细芬. 盐酸克伦特罗化学发光酶免疫分析方法的研究[D]. 天津： 天津科技大学， 2010. DOI：10.7666/d.y2082852.