溶磷细菌对复垦土壤有效磷及各形态无机磷含量的影响

乔志伟，洪坚平，方 曌，李仕蓉

(1.安顺学院 资源环境与工程学院，贵州 安顺 561000; 2.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801)

溶磷细菌对复垦土壤有效磷及各形态无机磷含量的影响

乔志伟1，洪坚平2*，方 曌1，李仕蓉1

(1.安顺学院 资源环境与工程学院，贵州 安顺 561000; 2.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801)

为探索溶磷细菌在复垦土壤中对磷的作用效果，采用室内摇瓶培养的方法，研究了溶磷细菌及其组合对磷酸钙的溶解能力，从而确定最佳组合，并探讨最佳组合溶磷细菌对复垦土壤有效磷及各形态无机磷含量的影响。结果表明，拉恩式菌(W2)+ 荧光假单胞菌1(W3)+荧光假单胞菌2(W4)培养液的有效磷含量最高，为609.1 mg/L，其为最佳溶磷细菌组合。施用此溶磷细菌组合肥可以增加复垦土壤有效磷含量,复垦土壤有效磷含量表现为BG(溶磷细菌肥+磷酸钙)处理>B(溶磷细菌肥)处理>MG(基质+磷酸钙)处理>M(基质)处理>CK(空白)，其中，B处理在苗期、拔节期、收获期分别比M处理显著增加15.7%、119.7%、54.1%，BG处理在苗期、拔节期、收获期分别比MG处理显著增加55.8%、91.8%、88.9%。在玉米苗期和收获期，施用溶磷细菌可以增加复垦土壤Ca2-P、Ca8-P、Fe-P、Al-P含量，其中收获期B处理比基质处理M分别显著增加86.6%、88.7%、38.6%、83.3%；复垦土壤O-P和Ca10-P含量均表现为MG>BG>M>B>CK，溶磷细菌对复垦土壤O-P含量影响较小，对Ca10-P含量影响较大，苗期和收获期B、BG处理Ca10-P含量分别比对应的基质处理M、MG处理降低5.8%、23.1%和9.5%、24.4%，即溶磷细菌可以减少复垦土壤Ca10-P的含量。土壤有效磷含量与土壤Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量呈极显著正相关，与O-P、Ca10-P含量无显著相关性。

溶磷细菌； 复垦土壤； 有效磷； 各形态无机磷

山西省是全国煤炭储量和开采量最大的省份，煤炭的大量开采必然会形成大面积的地下采空区和地面塌陷区。目前，山西省约有1/2的地下采空区发生了地面塌陷[1]，地面塌陷不仅造成农田大面积破坏，地面上河流断流，地下水受到污染，干旱区面积扩大，周围环境恶化，影响粮食产量和粮食安全，而且对人类的居住和生活都有一定程度的危害。因此，土地复垦迫在眉睫。相关研究表明，采煤塌陷地土地复垦成功的关键在于提高复垦土壤肥力[2-3]，而提高复垦土壤肥力的关键在于提高复垦土壤养分含量。其中，磷素养分是最重要的限制因子之一。土壤中普遍存在着溶磷微生物，它可以将土壤中难溶态磷转化为有效磷，因此，研究溶磷微生物对于提高复垦土壤肥力具有重要意义。其中研究最多的是溶磷细菌。目前，关于溶磷细菌的研究主要集中在复垦土壤培肥、生物活性及作物增产等方面。研究表明，在复垦土壤中施用含溶磷细菌生物肥后，土壤养分、生物活性、生化强度、作物产量较不施用含溶磷细菌生物肥的处理都有一定程度的增加，施用溶磷细菌生物肥有利于土壤熟化[4-6]。但对于溶磷细菌在复垦土壤中对各形态无机磷含量的影响研究尚未见报道；此外，溶磷细菌在土壤中的定殖受周围环境及土著微生物的影响，单一溶磷细菌在土壤中的应用效果不稳定。因此，采用复合溶磷细菌提高溶磷效率是最有效的措施。为此，通过室内摇瓶培养的方法确定不同种类溶磷细菌的最佳组合，并研究最佳组合溶磷细菌对复垦土壤有效磷及各形态无机磷含量的影响，为研究溶磷细菌在复垦土壤中的作用规律及其在实际生产中的施用奠定基础。

1 材料和方法

1.1溶磷细菌组合试验

1.1.1 供试菌株 供试菌株为从山西省太谷县农田的石灰性褐土中分离筛选并鉴定的溶磷细菌，其中蜡样芽孢杆菌(Waxybacillus)1株，编号为W1；拉恩式菌(Rahnellasp)1株，编号为W2；荧光假单胞菌(Fluorescentpseudomonas)2株，编号分别为W3和W4。

1.1.2 培养基 溶磷细菌活化培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL，固体培养基加琼脂15～20 g。

溶磷细菌液体发酵培养基(NBRIP)：葡萄糖10 g、MgCl25 g、(NH4)2SO40.1 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、Ca3(PO4)25 g、蒸馏水1 000 mL,调节pH值为7.0，112 ℃灭菌30 min，冷却备用。

1.1.3 菌株的活化 将蜡样芽孢杆菌W1、拉恩式菌W2、荧光假单胞菌W3、荧光假单胞菌W4分别接种在已灭菌的斜面活化培养基上培养18～24 h，备用。

1.1.4 不同溶磷细菌及其组合对磷酸钙溶解能力的测定 在250 mL三角瓶中加入100 mL已灭菌的溶磷细菌发酵培养基，将不同溶磷细菌及其组合(表1)分别接种在发酵液体培养基中，单一溶磷细菌接菌量为1 mL,组合溶磷细菌接菌总量也为1 mL，各组合不同溶磷细菌接菌量体积相同，将接种不同溶磷细菌菌液的三角瓶于30 ℃、150 r/min振荡培养7 d，并设置不接菌处理为对照，每个处理重复3次，测定培养液中的有效磷含量。

表1 不同溶磷细菌及其组合处理

1.2玉米盆栽试验

1.2.1 试验材料 试验土样来自山西省长治市襄垣县王桥镇洛江沟村潞安集团五阳煤矿采煤塌陷区，为复垦第2年土壤，土壤含有效磷4.35 mg/kg、有机质9.45 g/kg、全氮0.31 g/kg、全钾17.8 g/kg、全磷0.43 g/kg、碱解氮18.74 mg/kg，pH值为8.21。

试验中无机肥包括尿素(含N 46%)、磷酸二氢钾(含P2O551.9%、K2O 34.5%)、硫酸钾(含K2O 54.0%)和磷酸钙(含P2O545.8%)；基质为腐熟好的鸡粪，含有机质38.9%、N 2.15%、P2O51.06%、K2O 1.31%；溶磷细菌肥(有效活菌数≥0.5×107cfu/g)由筛选出的最佳组合溶磷细菌在高密度发酵罐中混合发酵，然后将发酵好的混合溶磷细菌菌液与基质按1∶9的比例在搅拌机中混匀制成。

供试玉米品种为先玉335。

1.2.2 试验设计 盆栽试验于2014年5月1日—9月30日在山西农业大学资源环境学院实验站温室大棚中进行，试验用盆钵为50 cm×35 cm的聚乙烯塑料盆，将从山西长治襄垣采煤塌陷区运回的复垦土壤风干过筛后装盆，每盆装土10 kg。试验共设空白(CK)、基质(M)、溶磷细菌肥(B)、溶磷细菌肥+磷酸钙(BG)、基质+磷酸钙(MG)5个处理，各处理肥料用量见表2，将肥料与土壤充分混合均匀，每盆分散点种玉米种子5粒。

表2 不同盆栽处理肥料用量 g/盆

1.2.3 土壤的采集 在玉米苗期、拔节期及收获期，用小的采土器采集0～20 cm根系土壤500 g，去除土壤中的根系及其他杂质，在实验室风干后过筛，备用。

1.3测定项目及方法

1.3.1 培养液及土壤有效磷含量 采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定培养液及土壤有效磷含量。

1.3.2 土壤无机磷分级 对苗期和收获后的土样，采用蒋柏藩等[7]的石灰性土壤磷分级测定法进行土壤无机磷分级测定。

1．4数据处理

试验数据采用Excel 2003和SAS 8.1进行处理分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1不同溶磷细菌及其组合对磷酸钙的溶解能力

由表3可知，所有处理有效磷含量均显著高于对照。W2+W4处理有效磷含量分别较单菌株W2、W4处理增加50.9%、3.2%，说明W2和W4在溶解磷酸钙过程中表现出协同增效的作用；同样地，W2+W3、W3+W4、W1+W3处理有效磷含量均大于单菌株处理，说明W2与W3、W3与W4、W1与W3在溶解磷酸钙过程中表现出协同增效的作用。W1+W2处理有效磷含量为375.1 mg/L，分别较单菌株W1、W2处理降低3.8%、2.7%，差异不显著，说明W1和W2在溶解磷酸钙过程中表现出竞争的作用。不同溶磷细菌组合中，W2+W3+W4处理有效磷含量最高，为609.1 mg/L，分别比单菌株W2、W3、W4处理显著增加58.0%、25.7%、8.1%，分别比W2+W3、W2+W4、W3+W4处理增加6.5%、4.7%、2.7%，说明菌株W2、W3与W4组合效果最好。根据不同溶磷细菌及其组合对磷酸钙溶解能力的大小，确定最佳溶磷细菌组合为W2+W3+W4。

表3 不同处理培养液中有效磷含量

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同。

2.2不同施肥处理对复垦土壤有效磷含量的影响

由表4可知，在玉米各生育时期，复垦土壤有效磷含量总体均表现为BG>B>MG>M>CK，施用溶磷细菌肥处理复垦土壤有效磷含量显著高于其他处理。其中，B处理在苗期、拔节期、收获期分别比M处理显著增加15.7%、119.7%、54.1%；BG处理土壤有效磷含量最高，在苗期、拔节期、收获期分别为36.13、36.88、23.31 mg/kg，分别比MG处理显著增加55.8%、91.8%、88.9%。

在玉米的整个生长周期内，由于玉米生长吸收利用土壤中的有效磷，CK、M、MG处理复垦土壤有效磷含量呈现下降的趋势；而B、BG处理土壤有效磷含量呈现先增加后降低的趋势，这是由于溶磷细菌肥中的溶磷细菌将复垦土壤中的难溶态磷转化为可以供给植物吸收利用的有效磷，从而在一定程度上补充土壤中因作物生长吸收利用而缺失的磷。

表4 不同施肥处理复垦土壤有效磷含量mg/kg

2.3不同施肥处理对复垦土壤各形态无机磷含量的影响

石灰性土壤无机磷包括二钙磷(Ca2-P)、八钙磷(Ca8-P)、十钙磷(Ca10-P)、铁磷(Fe-P)、铝磷(Al-P)和闭蓄态磷(O-P)等。

2.3.1 Ca2-P和Ca8-P 由表5可知，不同施肥处理对复垦土壤Ca2-P和Ca8-P含量影响显著。玉米苗期和收获期，Ca2-P和Ca8-P含量均以BG处理最高，MG、B处理次之，CK最低，所有处理之间差异显著，BG处理Ca2-P含量分别比MG处理显著增加63.2%和101.2%，Ca8-P含量分别比MG处理显著增加76.4%和155.2%；B处理Ca2-P含量分别比M处理显著增加22.0%和86.6%，Ca8-P含量分别比M处理显著增加35.7%和88.7%。综上，施用溶磷细菌肥可以显著增加复垦土壤Ca2-P和Ca8-P含量。

与苗期相比，收获期CK、M、B、BG、MG处理复垦土壤Ca2-P含量分别降低79.8%、53.0%、28.1%、60.9%、68.3%，Ca8-P含量分别降低65.6%、60.4%、44.9%、29.2%、51.1%。可见，在玉米整个生长过程中，CK复垦土壤Ca2-P和Ca8-P含量降低幅度最大，溶磷细菌肥各处理Ca2-P和Ca8-P含量降低幅度较低，说明施用溶磷细菌肥可以增加复垦土壤Ca2-P和Ca8-P含量，补偿作物生长对Ca2-P和Ca8-P的消耗。

表5 不同施肥处理复垦土壤Ca2-P和Ca8-P含量 mg/kg

2.3.2 Al-P 由图1可知，玉米苗期和收获期，所有处理土壤Al-P含量均显著高于CK，各处理土壤Al-P含量表现为BG>MG>B>M>CK，苗期B、BG处理分别较M、MG处理显著提高50.8%、23.1%，收获期B、BG处理分别较M、MG处理显著提高83.3%、33.8%。可见，施用溶磷细菌肥处理复垦土壤的Al-P含量高于基质处理，溶磷细菌肥中的溶磷细菌有利于土壤Al-P含量的增加。

玉米收获期，所有处理复垦土壤Al-P含量较苗期显著下降，CK、M、B、BG、MG处理分别降低44.1%、49.0%、38.0%、44.1%、48.6%。可见，施用溶磷细菌肥处理复垦土壤Al-P含量减少幅度小于不施溶磷细菌肥处理。

不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同图1 不同施肥处理复垦土壤的Al-P含量

2.3.3 Fe-P 由图2可知，玉米苗期和收获期，BG处理复垦土壤Fe-P含量最高，除与MG处理及收获期B处理差异不显著外，显著高于其他处理；B处理复垦土壤Fe-P含量高于CK和M处理，苗期和收获期分别比M处理增加12.8%和38.6%。与苗期相比，CK、M、B、BG、MG复垦土壤Fe-P含量分别下降了21.0%、27.2%、10.6%、16.6%、15.1%，可见溶磷细菌肥处理B复垦土壤Fe-P含量减少幅度最小。

图2 不同施肥处理复垦土壤的Fe-P含量

2.3.4 O-P和Ca10-P 由表6可知，玉米苗期和收获期，复垦土壤O-P和Ca10-P含量总体均表现为MG>BG>M>B>CK。溶磷细菌对复垦土壤O-P含量影响较小，使其基质处理降低幅度较小；而B、BG处理复垦土壤Ca10-P含量较基质处理降低幅度较大，苗期和收获期，B、BG处理分别比对应的基质处理M、MG降低5.8%、23.1%和9.5%、24.4%。与苗期相比，收获期施用溶磷细菌肥对复垦土壤O-P含量影响较小，其降低幅度较小；而CK、M、B、BG、MG处理复垦土壤Ca10-P含量较苗期分别下降了0.4%、1.5%、5.4%、5.3%、3.7%，可见溶磷细菌肥处理复垦土壤Ca10-P含量降低幅度大于基质处理。

表6 不同施肥处理复垦土壤O-P和Ca10-P含量 mg/kg

2.4复垦土壤各形态无机磷含量与有效磷含量的相关性分析

由表7可以看出，土壤有效磷含量与Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P、O-P、Ca10-P含量的相关系数分别为0.904、0.812、0.838、0.859、0.420、0.157。其中，土壤有效磷含量与土壤Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量呈极显著正相关，与O-P、Ca10-P含量无显著相关性。

表7 复垦土壤各形态无机磷含量与土壤有效磷含量的相关系数

注：**表示在0.01水平极显著相关。

3 结论与讨论

3.1溶磷细菌溶磷能力及组合效应

目前，国内大多数高效溶磷细菌对磷酸钙的溶解能力在600 mg/L左右。朱培淼等[8]分离筛选的1株溶磷细菌对磷酸钙的溶解能力为606.39 mg/L，王岳坤等[9]筛选出的1株溶磷细菌对磷酸钙的溶解能力为626.30 mg/L，任嘉红等[10]从南方红豆杉根际土壤中分离出的1株溶磷细菌，溶磷能力为 647.67 mg/L。本研究发现，W2+W3+W4对磷酸钙的溶解能力为609.10 mg/L，具有高效的溶磷能力；不同功能菌株之间既有协同作用，也有竞争关系，W2+W4、W2+W3、W3+W4、W1+W3对磷酸钙的溶解表现出协同增效作用，W1+W2在溶解磷酸钙方面表现出竞争作用，这可能是因为不同溶磷细菌在培养液中的生长情况不同，将不同溶磷细菌接种在同一培养液中，不同菌株之间对营养物质的需求会发生竞争关系，导致溶磷细菌溶磷能力减弱。

3.2溶磷细菌对土壤有效磷及各形态无机磷含量的影响

大量研究表明，溶磷细菌有利于土壤难溶态磷的有效化，可增加土壤有效磷含量并促进作物对土壤磷素的吸收[11-14]，这主要是由于溶磷细菌分泌低分子量有机酸引起的。本研究发现，在玉米整个生育时期，施用溶磷细菌肥处理复垦土壤有效磷含量高于基质处理。

溶磷微生物将土壤难溶态磷转化为有效磷，必然会对土壤各种形态的磷含量产生影响。范丙全等[15]研究表明，施用溶磷草酸青霉菌的土壤Ca2-32P、Ca8-32P比例增加，Ca10-32P比例降低；梁利宝[16]研究认为，溶磷细菌可以增加石灰性土壤Ca2-P、Al-P、Fe-P含量，降低土壤Ca8-P和Ca10-P含量，对O-P含量影响较小；周鑫斌等[17]、Gong等[18]研究表明，溶磷微生物可以促进难溶态Ca10-P和缓效态Ca8-P向有效态磷的转化，土壤中有效态磷Ca2-P和Al-P含量增加。

土壤各无机磷形态由于在土壤中的溶解度不同，对植物的有效性也不同，其有效性大小依次为Ca2-P>Al-P>Ca8-P>Fe-P>Ca10-P>O-P[19]。本试验中，土壤有效磷含量与Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P、O-P、Ca10-P含量的相关系数分别为0.904、0.812、0.838、0.859、0.420、0.157，根据土壤有效磷含量与各形态无机磷含量的相关性得出，复垦土壤中无机磷形态有效性较大的是Ca2-P、 Ca8-P、Al-P 和Fe-P，施用溶磷细菌可以增加复垦土壤中Ca2-P、Al-P、Ca8-P、Fe-P含量，补充因作物生长作用对这些无机磷形态的消耗，增加复垦土壤磷素的有效性；溶磷细菌可以减少复垦土壤中Ca10-P的含量，但对O-P含量影响较小。

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Effect of Phosphate-solubilizing Bacteria on Available Phosphorus and Various Forms of Inorganic Phosphorus Contents in Reclaimed Soils

QIAO Zhiwei1，HONG Jianping2*，FANG Zhao1，LI Shirong1

(1.College of Resources and Environment Engineering，Anshun College，Anshun 561000，China;2.College of Resources and Environment，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

In order to explore the effect of phosphate-solubilizing bacteria on phosphorus(P),the tricalcium phosphate-solubilizing abilities of phosphate-solubilizing bacteria and their combinations were tested using laboratory shake-flask culture,so as to determine the optimal combination,and then the effect of the optimal combination of phosphate-solubilizing bacteria on the available P and various forms of inorganic P contents in reclaimed soils was studied.The results showed that the available P content was the highest in the culture broth ofRahnellasp (W2)+ fluorescentPseudomonas1 (W3)+ fluorescentPseudomonas2 (W4),which was 609.1 mg/L.Thus,W2+W3+W4 was selected as the optimal combination of phosphate-solubilizing bacteria.The application of fertilizer with optimal combination of phosphate-solubilizing bacteria increased available P content in reclaimed soil,and the order was BG(phosphate-solubilizing bacteria fertilizer+ tricalcium phosphate)>B(phosphate-solubilizing bacteria fertilizer)>MG(matrix+tricalcium phosphate)>M(matrix)>CK(blank).At the corn seedling,jointing and harvest stage,the contents of available P of B treatment significantly increased by 15.7%,119.7%,54.1% compared with the M treatment,respectively;the contents of available P of BG treatment increased by 55.8%,91.8%,88.9% compared with the MG treatment,respectively.At the corn seedling and harvest stage,the application of phosphate-solubilizing bacteria fertilizer significantly increased by 86.6%,88.7%,38.6%,83.3% compared with the M treatment at the harvest stage,respectively;the order of Ca10-P and O-P contents was MG>BG>M>B>CK,the influence of phosphate-solubilizing bacteria on the content of O-P was small,the influence of phosphate-solubilizing bacteria on the content of Ca10-P was big,the Ca10-P contents of B and BG treatments decreased by 5.8%,23.1% and 9.5%,24.4% compared with the M and MG treatments,indicating that phosphate-solubilizing bacteria could decrease the content of Ca10-P in reclaimed soil.Soil available P content had significantly positively correlation with contents of Ca2-P,Ca8-P,Al-P,Fe-P,and no significant correlation with the contents of O-P and Ca10-P.

phosphate-solubilizing bacteria; reclaimed soils; available phosphorus; various forms of inorganic phosphorus

2017-04-08

贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字[2016-7280号]);山西省科技攻关项目(20121101009-4)；贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字[2014-7515号])；安顺学院博士科研启动基金项目(asubsjj201601号)

乔志伟(1985-)，男，山西大同人，副教授，博士，主要从事土壤功能微生物的筛选及应用研究。 E-mail：704725646@qq.com

*通讯作者：洪坚平(1958-)，男，浙江绍兴人，教授，主要从事复垦区土壤熟化研究。E-mail：hongjpsx@163.com

S154.3

： A

： 1004-3268(2017)09-0050-06