蒙药材手掌参中总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究

2017-11-17邬卫东杨来秀武俊婷

中国医药导报 2017年28期

邬卫东　杨来秀　武俊婷

[摘要] 目的优选手掌参总黄酮的最佳提取工艺，并建立其含量测定方法，同时对手掌参总黄酮的抗氧化活性进行研究。方法通过正交试验选择手掌参总黄酮的提取工艺；采用比色法以芦丁为对照测定手掌参中总黄酮的含量。采用羟基自由基清除法评价其抗氧化活性。结果最佳提取工艺为90%乙醇，料液比1∶20，回流提取2次，每次60 min；芦丁在0.1094～0.8752 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系，平均回收率为98.8%，RSD为1.05%。手掌参总黄酮对羟基自由基有较强的清除作用。结论优选的提取工艺稳定可靠，含量测定方法简便，准确、重复性好，不同产地手掌参中总黄酮的含量差异较大。手掌参总黄酮具有一定的抗氧化活性。

[关键词] 手掌参；总黄酮；提取工艺；含量测定；抗氧化

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0034-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of total flavonoids in Gymnadenia conopsea， establish a method of its content determination and research its antioxidant activities. Methods The orthogonal experiments was used to optimize the extraction process of total flavonoids in Gymnadenia conopsea. The content of total flavonoids were determined using rutin as reference by colorimetric. The antioxidant activity was evaluated by hydroxyl free radical scavenging activity. Results The optimized extraction conditions were 90% ethanol as solvent， material -liquid ratio of 1∶20， reflux extraction 2 times， each time 60 min. Rutin showed good linear relationship in the range of 0.1094-0.8752 mg， the average recovery was 98.8%， RSD was 1.05%. The total flavonoids possessed potential scavenging activity of hydroxyl free radical. Conclusion The optimum extraction process is stable， reliable， the method of content determination is simple， accurate， reproducible. The content of total flavonoids is quite different in Gymnadenia conopsea of different areas. The total flavonoids in Gymnadenia conopsea have obvious antioxidant activities.

[Key words] Gymnadenia conopsea； Total flavonoids； Extraction process； Content determination； Antioxidant

手掌参（Gymnadenia conopsea R.Broyn.）蒙药名为额日赫騰乃一嘎日，异名旺拉嘎，系兰科手参属多年生草本植物手参（Gymnadenia conopsea R.Broyn.）的干燥块根[1]，具有生津壮阳功效。用于遗精，亏精，阳痿，肾寒，腰腿疼痛，巴木病，痛风，游痛症，久病体虚等症[2]，蒙药手掌参作为珍贵的传统药材，具有很高的临床药用价值[3-6]。手掌参中主要化学成分：有机酸苄酯苷类、二苯乙烯（茋）类和菲类、皂苷类以及多糖等[7-11]。目前对手掌参定性定量研究较少[12-19]，黄酮类[20-22]成分未见文献报道，本文对手掌参中总黄酮的提取工艺进行优选，对黄酮类成分进行了定性鉴别和定量测定，并对其抗氧化活性进行初步研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TU-1901型可见紫外分光光度计（北京），KQ-5200E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司，250 W，50 Hz），其他容量仪器均经校正。

1.2 试药

手掌参药材（均购自呼和浩特天力大药店，经内蒙古医科大学药学院生药教研室杨来秀教授鉴定，产地分别为吉林、辽宁、四川），芦丁对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号：100080-20141018），BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）购自Sigma-ALdrich（Sigma公司，美国），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液取手掌参粉末约1 g，精密称定，加90%乙醇20 mL，回流提取2次，每次60 min，滤过，滤液浓缩后定容至25 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液精密称取芦丁对照品适量，加少量甲醇溶解后，用90%乙醇稀释成每毫升含芦丁0.2188 mg的溶液，作为对照品溶液。endprint

2.2 定性鉴别

2.2.1 盐酸-镁粉反应取供试液2 mL两份，分置两支试管中，其中1支加入少量镁粉，并滴加盐酸数滴，同置于水浴上加热1 min后，结果不加盐酸镁粉的溶液为浅黄色，加盐酸镁粉变为红棕色。

2.2.2 三氯化鋁反应取供试液各5 mL，分置两支试管中，其中1支加入少量1%三氯化铝溶液，结果不加三氯化铝溶液为浅黄色，加三氯化铝溶液显黄绿色荧光。

2.3 测定波长的选择

精密量取供试品溶液4 mL，置10 mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min，加1 moL/L氢氧化钠4 mL，用溶剂定容至刻度，摇匀，放置15 min。以不加氢氧化钠的溶液为空白。在370～700 nm波长范围内进行光谱扫描，另精密量取对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，同法操作。结果供试品溶液和对照品溶液的最大吸收波长均为506 nm，故选择506 nm作为测定波长。

2.4 提取方法的选择

分别将下述三种提取液滤过，各精密量取4 mL，按“2.3”项下显色方法显色，测定，结果分别是2.584、2.970、3.552。结果回流法总黄酮含量较高，故选择回流提取。

2.4.1 超声法称取手掌参粉末（吉林）约1 g，精密称定，精密加入80%乙醇25 mL，超声提取1 h。

2.4.2 浸泡后超声法称取手掌参粉末（吉林）约1 g，精密称定，精密加入80%乙醇25 mL，浸泡过夜后，超声提取1 h。

2.4.3 回流法称取手掌参粉末（吉林）约1 g，精密称定，精密加入80%乙醇25 mL，回流提取1 h。

2.5 正交试验设计

2.5.1 正交试验的因素与水平在单因素试验的基础上，设计了4因素3水平的正交试验，各因素水平见表1。

2.5.2 正交试验方案与结果根据表2的正交试验因素和水平，按L9（34）设计正交试验方案，精密称取手掌参粉末（辽宁1）进行实验，结果见表2。由表2结果可知，影响提取率的因素依次为A>B>C>D，经过方差分析四个因素均无显著性差异，故由直观分析确定最佳提取工艺条件为A3B3C2D2，即乙醇浓度为90%，料液比1∶20，提取次数为2次，提取时间为60 min。并对最佳条件进行三次验证实验，结果手掌参中总黄酮的平均含量为2.372 mg/g，说明提取条件稳定可靠。

2.6 含量测定

2.6.1 线性关系考察分别精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，按“2.3”项下的显色方法进行操作，在506 nm波长处测定吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归，回归方程为：y=1.0671x-0.0004，r=0.9998。

2.6.2 精密度试验将显色后的供试品溶液，于506 nm波长处连续测定6次，结果RSD为0.22%，说明仪器的精密度良好。

2.6.3 重复性试验取手掌参粉末（辽宁1）约1 g 6份，精密称定，加90%乙醇20 mL，回流提取2次，每次60 min，过滤，滤液浓缩并定容至25 mL，精密吸取4 mL，置10 mL量瓶中，按照“2.3”项下显色方法进行操作，在506 nm波长处测定吸光度。根据回归方程计算含量，结果平均含量为2.326 mg/g，RSD为1.72%。

2.6.4 稳定性试验对显色后的供试品溶液每隔5 min测定1次吸光度，结果表明，供试品溶液在显色30 min内稳定，RSD为0.49%。

2.6.5 加样回收率试验取已知含量的手掌参粉末（辽宁1，含量2.326 mg/g）约0.5 g 9份，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.502 mg/mL）2、2.5、3.0 mL各三份，按“2.1.1”和“2.3”项下方法进行操作，计算回收率。结果见表3。

2.6.6 样品测定对不同产地手掌参粉末按照“2.6.3”项下操作，计算含量，结果见表4。

2.7 抗氧化活性的测定

2.7.1 手掌参不同浓度总黄酮溶液的制备精密称取手掌参粉末适量，按正交试验选择的最佳提取工艺提取，合并提取液，定容，精密吸取适量，根据各批手掌参总黄酮含量，稀释成不同浓度的系列溶液。

2.7.2 羟基自由基清除能力的测定分别精密吸取上述各系列溶液1.0 mL，于10 mL具塞试管中，依次精密加入2 mmoL/L FeSO4溶液3 mL，1 mmoL/L H2O2溶液3 mL，摇匀，再加入6 mmoL/L水杨酸溶液3 mL，摇匀，置37℃水浴反应60 min，以1 mL 75%乙醇、6 mL 95%乙醇及3 mL蒸馏水作为空白，在525 nm波长处测定其吸光度Ai，同上述操作，以3 mL蒸馏水代替H2O2溶液测定本底吸光度Aj；1mL蒸馏水代替样品溶液测定空白对照液的吸光度A0，以BHT作为阳性对照[23]，根据以下公式计算清除率。清除率=1-[（Ai-Aj）/A0]×100%。

以清除率对浓度进行线性回归，计算相关系数和EC50，5批手掌参药材及BHT的测定结果见表5，以总黄酮的浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制曲线，见图1。由表5和图1可知，不同批号的手掌参对羟自由基清除作用明显，总黄酮浓度在0.03036～0.3551 mg/mL范围内，其羟自由基的清除率为15.75%～90.31%，且随着手掌参总黄酮浓度增大，对羟自由基清除能力也逐步增加，说明手掌参中的总黄酮具有显著清除羟基自由基的作用。

3 讨论

本试验优选所得的手掌参总黄酮最佳提取工艺条件为：溶剂浓度90%，料液比1∶20，回流提取2次，每次提取60 min；并对手掌参中总黄酮含量进行了测定，但属于哪种类型的黄酮还有待于进一步研究。试验结果表明，不同产地的手掌参药材中总黄酮的含量差异较大，且其抗氧化能力与总黄酮含量成正比关系。endprint

[参考文献]

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