飞扬肠胃炎胶囊体外抑菌作用研究

李瑶　杨倩　周丹

[摘要] 目的 探讨飞扬肠胃炎胶囊的体外抑菌效果。 方法 采用试管二倍稀释法联合琼脂平板法，以头孢曲松钠为阳性对照药，测定飞扬肠胃炎胶囊对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌、白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。 结果 飞扬肠胃炎胶囊对大肠埃希菌（MIC为6.25 mg/mL）、金黄色葡萄球菌（MIC为1.56 mg/mL）、粪肠球菌（MIC为25.00 mg/mL）、铜绿假单胞菌（MIC为6.25 mg/mL）、β-溶血性链球菌（MIC为12.50 mg/mL）的体外抑菌作用较强，对白色念珠菌（MIC为100.00 mg/mL）的体外抑菌作用较弱。 结论 飞扬肠胃炎胶囊对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌具有较强的体外抑菌作用。

[关键词] 飞扬肠胃炎胶囊；试管二倍稀释法；最小抑菌浓度；抑菌作用

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the antimicrobial activity in vitro of Feiyang Changweiyan Capsules. Methods The tube double dilution method and agar plate method were used to determine the minimum inhibitory concentrations （MIC） and minimum bactericidal concentrations （MBC） of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa， β-hemolytic streptococcus and Candida albicans， taking Ceftriaxone as positive control drug. Results The antibacterial activity of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil （MIC was 6.25 mg/mL）， Staphylococcus aureus （MIC was 1.56 mg/mL）， Enterococcus faecalis （MIC was 25.00 mg/mL）， Pseudomonas aeruginosa （MIC was 6.25 mg/mL） and β-hemolytic streptococcus （MIC was 12.50 mg/mL） was stronger， which of Candida albicans （MIC was 100.00 mg/mL） was weaker. Conclusion Feiyang Changweiyan Capsules have stronger antimicrobial activity in vitro for Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa and β-hemolytic streptococcus.

[Key words] Feiyang Changweiyan Capsules； Tube double dilution method； Minimum inhibitory concentrations； Antimicrobial activity

飛扬肠胃炎胶囊由飞扬草、火炭母、救必应三味中药组成，具有泻火解毒、除湿止痢的功效，临床上用于细菌性痢疾和急、慢性肠胃炎的治疗，疗效显著，副作用小[1]。飞扬草为大戟科大戟属植物飞扬草（Euphorbia hirta L.）的干燥全草，主要分布于我国南方、日本、印度和亚热带地区[2]。据报道，飞扬草在印度常用于女性疾病和儿童寄生虫感染的治疗，此外，对呼吸系统疾病、鼻炎、支气管炎等有良好的作用[3]。现代研究表明[4-6]，飞扬草乙醇提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的生长有抑制作用，正己烷提取物对小鼠醋酸丙酯引起的炎症有治疗作用。火炭母是蓼科植物火炭母（Polygonum chinense L.）的药用全草，临床上主要用于湿热泄泻、痢疾、湿热疮疹、霉菌性阴道炎等疾病的治疗[7-8]，火炭母的茎和叶提取物对细菌有抑制作用[9]。救必应为冬青科植物铁冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮，常用于乳娥、腹泻、痢疾的治疗[10]。研究表明，救必应的乙醇提部位和蒸馏水提取部位均有较强的抑菌作用[11]。虽然关于飞扬草、火炭母、救必应三个单味药的抗菌抗炎作用以及其他药理研究较多，但对此三味药组方而成的飞扬肠胃炎胶囊的抗菌抗炎作用研究较少，所以本研究选取6种常见致病菌，测定飞扬肠胃炎胶囊的体外抑菌作用，为探讨该药作用机制及进一步扩大适应证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、粪肠球菌（ATCC29212）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、β-溶血性链球菌（临床菌株）、白色念珠菌（ATCC 90028）均由第四军医大学第一附属医院微生物检验科提供。

1.2 药物

飞扬肠胃炎胶囊（陕西君碧莎制药有限公司，批准文号：国药准字Z20080523）；注射用头孢曲松钠（上海罗氏制药，批号：SH6101）。endprint

1.3 培养基

营养肉汤培养基干粉（英国OXOID公司，批号：201603291）；血琼脂培养基（英国OXOID公司，批号20160114B）。

1.4 仪器与设备

MLS-3750高压蒸汽灭菌锅（日本三洋），Centrifuge 5418R小型冷冻高速离心机（德国艾本德公司），BSC-1360ⅡB2生物安全柜（HDL公司），微量加样器（吉尔森公司），BSA224S赛多利斯分析天平（德国赛多利斯公司），HF212UV CO2培养箱（上海力康），麦氏比浊仪（法国梅里埃）。

1.5 供试品药液的配制

称取10 g飞扬肠胃炎胶囊内容物，加适量蒸馏水（16倍）回流提取90 min，抽虑，滤液蒸干得样品1。称取10 g飞扬肠胃炎胶囊内容物，加适量75%乙醇（16倍）回流提取90 min，抽虑，滤液蒸干得样品2。

分别称取3.0 g样品1和样品2，加入15 mL无菌生理盐水，待完全溶解后，12 000 r/min，r = 7.7 cm，离心10 min，吸取上清液过0.22 μm无菌滤膜，即得浓度为200 mg/mL的样品1和样品2原药液。

精密称取对照药2.56 mg注射用头孢曲松钠干粉，加10 mL无菌生理盐水溶解，即得浓度为256 mg/L的原药液。

1.6 菌液的制备

用无菌接种环将冻存的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌、白色念珠菌以三段划线法接种于无菌血琼脂培养基上，经35℃恒温培养24 h后，采用麦氏比浊法，用生理盐水校正各菌液浓度至0.5麦氏比浊标准（即1.5×108 CFU/mL）待用。

1.7 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）2007标准，采用试管二倍稀释法测定药物MIC[12-13]。每个菌种的抑菌实验取灭菌试管2排，每排11管，每管加入1 mL灭菌营养肉汤，分别在第1管中加入1 mL样品1原液和样品2原液，混匀，然后吸取1 mL至第2管，混匀后再吸取1 mL至第3管，连续倍比稀释至第9管，到第9管时弃去1 mL，此时各管药物浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.781 25、0.390 625 mg/mL，此外，在β-溶血性链球菌的两排试管中分别加入无菌脱纤羊血100 μL。然后每管中分别加入调整好的各菌株稀释液10 μL，使每管最终菌液浓度为105 CFU/mL。因真菌比细菌大，故真菌最终浓度约为104 CFU/mL。第10管为无菌阴性对照，第11管为无药阳性对照。同样取12只灭菌试管排成一排，每管加入1 mL灭菌营养肉汤，在第1管中加入对照品原液1 mL混匀，其余操作同上，各管药物浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L，第11管为无菌阴性对照，第12管为无药阳性对照。样品1、样品2和阳性药物MIC测定分别重复3次，以3次数值相同为最终结果。

因中药本身颜色较深以及人的视觉差异，需采用琼脂平板法转板来确定其MBC值，以提高对药物抑菌作用判定的准确性。在判定完药物对应菌的MIC值后，从MIC值所对应药物浓度及以上的试管中分别用无菌接种环取10 μL培养物，采用平板划线法将培养物接种于血琼脂培养基上，置35℃恒温培养箱培养，24 h后观察平板上是否有菌落生长，以不生长菌落的最高药物稀释浓度为飞扬肠胃炎胶囊对该菌的MBC。

2 结果

2.1 飞扬肠胃炎胶囊不同溶剂提取物及注射用头孢曲松钠对6种菌的效力

阴性对照组中无菌的液体培养基和平板均无菌生长，阳性对照组试管有菌生长，出现浑浊，同时划平板培养的菌落生长良好，且本研究所测得的注射用头孢曲松钠值与CLSI的参考值以及文献报道注射用头孢曲松钠MIC值[14]进行对比，可知，本研究结果有效。见表1。

2.2 飞扬肠胃炎胶囊对6种常见菌的MIC

飞扬肠胃炎胶囊水提取物对大肠埃希菌和β-溶血性链球菌的抑菌作用更好，飞扬肠胃炎胶囊醇提取物对大肠埃希菌和β-溶血性链球菌的抑制作用比水提取物稍弱，飞扬肠胃炎胶囊水提物和醇提物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的抑菌效力相当。见表2。

2.3 飞扬肠胃炎胶囊对6种常见菌的MBC

飞扬肠胃炎胶囊水提物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌的抑菌作用相当，飞扬肠胃炎胶囊醇提物对大肠埃希菌的杀菌作用稍弱于水提物。对比飞扬肠胃炎胶囊不同提取物的MIC值和MBC值可知，MBC值比MIC值浓度高2～4个梯度。见表3。

综合分析以上结果，飞扬肠胃炎胶囊对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌及粪肠球菌有较强的抑菌作用，对白色念珠菌的抑菌作用较弱。

3 讨论

飞扬肠胃炎胶囊由飞扬草、火炭母、救必应三味中药组方而成，其中君药飞扬草可清热解毒利湿，祛除肠道湿热邪气，臣药火炭母可增强飞扬草的解毒利湿功效，佐使药辅助飞扬草和火炭母利湿解毒之功，止痛功效可改善腹痛症状。

人体作为一个生命整体，其局部微生态是人生命环境的一部分，微生物群之间是有联系的，有学者认为人体的肠道和阴道的微生态平衡存在着相互调节的作用[14]。妇科炎症和肠胃炎的发生与阴道微生物群和肠道微生物群的紊乱有关[15-18]，飞扬肠胃炎胶囊又有应用于女性疾病治疗的历史，结合飞扬肠胃炎胶囊组方中三味药物良好的抑菌作用，本研究选择了引起妇科炎症的6种常见致病菌，进行飞扬肠胃炎胶囊的体外抑菌实验研究，通过体外抑菌实验初步确定飛扬肠胃炎胶囊对妇科炎症常见菌的作用。实验结果表明，飞扬肠胃炎胶囊对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、β-溶血性链球菌及粪肠球菌抑制作用较强，对白色念珠菌抑制作用较弱。根据体外研究结果，笔者下一步会继续进行体内动物实验研究，探讨飞扬肠胃炎胶囊对妇科炎症的治疗作用，为扩大飞扬肠胃炎胶囊适应证研究提供理论依据。endprint

由于中草药提取液本身颜色较深，且中药制剂的一大特点是“药辅合一”，即选择制剂处方中的某些药味既作为药物又作为辅料，减少其他辅料的用量[19]，这就使得中成药溶解后会出现颜色较深且浑浊的现象，影响体外抑菌实验终点的判断。

本研究对药物进行前期处理，按照药物原制备工艺，分别选择蒸馏水和75%乙醇对飞扬肠胃炎胶囊进行重新提取，得到澄清度较高的原药液，再结合琼脂平板法测定MBC，提高了飞扬肠胃炎胶囊体外抑菌效果判断的准确性。本研究中采用重新提取除去辅料并结合平板法能减少中药颜色对结果判断造成的影响，得出的结果可靠，因此，此方法可以为以后中药类制剂的体外抑菌实验方法提供参考。实验中选择注射用头孢曲松钠作为阳性对照药，因为现有国内测定中药类MIC值并没有标准的MIC值参考，也没有统一的MIC实验室测定标准，选择注射用头孢曲松钠注射液作为阳性对照药，测定的MIC值与美国临床和实验室标准协会及文献报道注射用头孢曲松钠MIC值[20]进行对比，可确定本研究操作方法和条件符合要求，测出的MIC值有参考价值。

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（收稿日期：2017-06-04 本文編辑：张瑜杰）endprint