DAPT对骨肉瘤U2OS细胞增殖和凋亡影响的实验研究

胡国海　代国　刘盖为

[摘要] 目的 观察γ-分泌酶抑制剂DAPT对人骨肉瘤细胞系U2OS增殖和凋亡的影响，探讨DAPT抑制骨肉瘤增殖并诱导其凋亡的可能机制。 方法 采用体外培养人成骨肉瘤细胞系U2OS，CCK-8法检测不同浓度DAPT对成骨肉瘤细胞系U2OS生长的抑制作用；Annexin V-FITC/PI双标染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率；Hoechst 33258染色，倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化；应用RT-PCR和Western blot法检测DAPT对凋亡通路相关mRNA和蛋白表达的影响；采用Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性变化。 结果 CCK-8检测显示5～50 μmol/L的DAPT可抑制人骨肉瘤U2OS细胞增殖并具有时间和剂量依赖性；流式细胞术检测显示5、10、20 μmol/L的DAPT可明显诱导骨肉瘤U2OS细胞发生凋亡，与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）；5、10、20 μmol/L的DAPT处理后，Hoechst 33258染色可见凋亡小体；RT-PCR和Western blot分析显示，经DAPT（5、10、30 μmol/L）处理后的骨肉瘤细胞系U2OS表达Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA较对照组明显增高（P < 0.05），促凋亡蛋白Bax表达增加（P < 0.05），抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P < 0.05）；Caspase活性檢测显示，DAPT（5、10、20、30 μmol/L）处理后，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性较对照组明显升高（P < 0.05）。 结论 γ-分泌酶抑制剂DAPT对骨肉瘤细胞系U2OS的增殖有显著抑制作用，并可诱导其发生凋亡，其作用机制可能与激活Caspase依赖的凋亡途径有关。

[关键词] γ-分泌酶抑制剂；DAPT；骨肉瘤；增殖；凋亡

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0004-06

[Abstract] Objective To observe the effect of gamma secretase inhibitor DAPT on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS， and to explore the possible mechanism of DAPT inhibiting osteosarcoma proliferation and inducing apoptosis. Methods Osteosarcoma cell line U2OS was cultured in vitro. Cell proliferation was tested by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Double stained by Annexin V-FITC and Propidium Iodide （PI）， the cells were detected by flow cytometry （FCM） for apoptosis. Hoechst 33258 was used to detect the morphological change of typical apoptotic cells. The apoptosis related mRNA and protein levels in U2OS were detected by RT-qPCR and Western blot. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 were measured with Caspase activity assay kit. Results CCK-8 assay showed that 5-50 μmol/L DAPT inhibited the proliferation of human osteosarcoma U2OS cells and in a time- and dose-dependent manners. Flow cytometry showed that 5， 10 and 20 μmol/L DAPT could significantly induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells， compared to the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Apoptotic body could be observed by Hoechst 33258 staining after treatment with 5， 10 and 20 μmol/L DAPT. RT-PCR and Western blot analysis showed that after treatment with DAPT （5， 10， 30 μmol/L）， the expression of Caspase-3， 8 ，9 mRNA were higher than those of control group （P < 0.05）， the pro-apoptotic protein Bax increased （P < 0.05）， and anti-apoptosis protein Bcl-2 protein decreased （P < 0.05）. The activities of Caspase-3， Caspase-8 and Caspase-9 promoted obviously after treatment with DAPT （5， 10， 20， 30 μmol/L） when compared with the control group （P < 0.05）. Conclusion DAPT can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS. Its mechanism of action may be related to activation of Caspase dependent apoptosis pathway.endprint

[Key words] γ-secretase inhibitor； DAPT； Osteosarcoma； Proliferation； Apoptosis

骨肉瘤是一种临床上常见的骨原发恶性肿瘤，起源于间叶组织，占恶性骨肿瘤的20%～45%，以青少年患者居多，易复发和早期发生远处转移。自20世纪70年代开始引入新辅助化疗的理念，使患者的5年生存率從不足20%提高到65%～70%[1-2]。保肢手术的开展也使患者的生存质量得到显著改善与提高。但是，骨肉瘤局部复发率并没有因为新辅助化疗而降低，始终维持在10%～20%，伴有肺部转移的患者5年生存率亦不足20%[3]。近40年来，虽然治疗方案在不断的改进，但仍然无法解决肿瘤复发、转移及耐药的问题，这使得骨肉瘤治疗处在瓶颈期[2，4]。因而寻找新的或更加有效的治疗药物或治疗方式显得极为紧迫。

研究发现，Notch信号通路在骨肉瘤的发生与发展中起了极为重要的作用[5-6]。Notch基因最早发现于果蝇中，其突变可导致果蝇残翅而得名，Notch信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的，当配体与受体结合后，经过2次酶切形成NICD（Notch intracellular domain）前体，关键的裂解发生在第3次酶切位点上，由早老素依赖的γ-分泌酶进行，酶切后释放Notch受体真正的激活形式NICD。随后，NICD转移至细胞核内，参与基因调控[7]。γ-分泌酶抑制剂DAPT可有通抑制Notch通路中的关键蛋白γ-分泌酶，从而有效抑制Notch的活化。国内外研究表明，DAPT在体外、体内对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用，如卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌[8-11]。前期研究表明，Notch信号通路在骨骼的发育和骨的重塑中都起到重要作用，Notch信号通路失调会导致骨的发育障碍甚至形成骨肉瘤[12]。还有学者指出，Notch信号通路对促进骨肉瘤发生与转移也起到关键作用[13]。因此，如若通过药物或者其他方式特异性地阻断Notch信号通路有可能成为潜在的治疗骨肉瘤的靶点。

本研究拟通过应用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路，从而研究DAPT对人骨肉瘤U2OS细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡的能力，并进一步检测了其对凋亡相关通路的影响，旨在为进一步明确γ-分泌酶抑制剂DAPT的抗肿瘤作用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

人骨肉瘤细胞系U2OS购自中国科学院细胞库（the Cell Bank of Chinese Academy of Sciences，中国，上海）。DMEM培养基、新鲜小牛血清为Hyclone公司产品；γ-分泌酶抑制剂DAPT购自Sigma公司（美国），用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的储存液分装备用，使用时用无血清DMEM培养基稀释到所需浓度，DMSO的含量小于0.1%；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）购自同仁化学研究所（日本）；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基公司（南京）；DMSO、Hoechst 33258及胰蛋白酶均购自Sigma公司（美国）；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（上海）；一抗Bax、Bcl-2和GAPDH均购自CST（美国）公司；BCA检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（上海）；总蛋白提取试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；垂直电泳仪购自北京六一仪器厂；TRIzol法总RNA提取试剂盒购自Takara（日本）；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR相关试剂购于Thermo（美国）公司；所有引物由上海生工合成（上海）。

1.2 细胞培养

用含10%小牛血清、1%双抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）的DMEM培养液在37℃、5%CO2、95%空气以及饱和湿度孵育箱中常规培养，每48小时换液一次，用0.25%含EDTA胰酶消化液消化、传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8法检测DAPT对U2OS细胞增殖的影响

取对数生长期的细胞，制成1×105/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h待其贴壁后加入终浓度分别为5、10、20、30、40、50 μmol/L DAPT，阴性对照组加等体积的DMEM培养液处理（每个浓度设5个复孔），每个浓度处理24、48、72 h后，加入CCK-8 10 μL、培养液90 μL继续培养2 h，在酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度OD值，实验重复3次。按公式计算细胞的存活率：细胞存活率=[（As-Ab）]/[（Ac-Ab）]×100%，其中，As为给药实验组OD值（含有细胞的培养基、CCK-8、毒性物质），Ac为阴性对照组OD值（含有细胞的培养基、CCK-8、没有毒性物质），Ab为空白孔OD值（不含细胞的培养基、CCK-8）。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测DAPT对U2OS细胞凋亡的影响

收集处于对数生长期的骨肉瘤U2OS细胞，胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，计数后调整细胞密度为2×105/mL，按2 mL/孔接种于6孔板，37℃、5%CO2、95%空气以及饱和湿度孵育箱中常规培养24 h，待细胞完全贴壁后吸弃原培养液，加入含有终浓度分别为5、10、20 μmol/L的DAPT新鲜DMEM培养液，同时设立对照组（0 μmol/L DAPT）。药物作用48 h后，各组重复3次，经胰酶消化，收集细胞于流式管内，1500 r/min 4℃离心5 min，弃上清，4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，用稀释好的结合缓冲液（结合缓冲液∶去离子水按1∶10稀释）90 μL重悬细胞。每管依次加Annexin V-FITC 5 μL，再加入5 μL PI（Propidium Iodide）染色液，轻轻混匀，室温下避光孵育5 min，上流式细胞仪进行细胞凋亡检测。以Annexin V-FITC为横坐标轴，以PI为纵坐标轴，右上象限代表晚期凋亡的细胞（Annexin V-FITC阳性，PI阳性），右下象限代表早期凋亡的细胞（Annexin V-FITC阳性，PI阴性），左上象限代表坏死细胞碎片（Annexin V-FITC阳性，PI阳性），左下象限代表活细胞（Annexin V-FITC阴性，PI阴性）。endprint

1.5 Hoechst 33258检测细胞凋亡

选取对数生长期的U2OS细胞接种于6孔板中，行细胞玻璃爬片实验，采用经CCK-8和流式检测作用较明显的5、10、20 μmol/L DAPT分别作用，含等体积DMSO的DMEM培养基作为对照组。收集作用48 h后的细胞，PBS洗2次，用4%的多聚甲醛室温固定20 min，PBS漂洗数次，Hoechst 33258常温避光染色10 min后置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 RT-RCR分析天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族基因的表达

选取对数生长期的U2OS细胞以1×105个/孔的密度种植于6孔板中，待细胞密度长至约70%时，加入含DAPT的新鲜培养液，使其终浓度分别为0、5、10、30 μmol/L，各组重复3次。药物处理48 h后去除培养液，Trizol提取RNA，以总RNA为模板，行逆转录，反应条件为70℃ 5 min，42℃ 1 h，95℃ 10 min。PCR反应条件为94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，30～50个循环；72℃延伸5 min。以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的相对表达水平。相关引物序列见表1。

1.7 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平

选取对数生长期的U2OS细胞以1×105个/孔的密度种植于6孔板中，待细胞密度长至约70%时，加入含DAPT的新鲜培养液，使其终浓度分别为0、5、10、30 μmol/L，各组重复3次。药物处理48 h后，去除培养液，收集细胞，PBS清洗离心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA法），SDS-PAGE电泳，然后电转至PVDF膜，将膜封闭于含5%脱脂奶粉的TBST，室温封闭1 h；兔抗人Bax、Bcl-2、GAPDH单克隆抗体稀释后（1∶1000）4℃过夜，二抗稀释后室温封膜2 h，暗室ECL化学发光，胶片显影，定影。以GAPDH为内参，评价蛋白相对表达量。

1.8 Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测

采用Caspase活性检测试剂盒测定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，分别将0、5、10、20、30 μmol/L DAPT处理过的细胞在冰上用裂解液裂解15 min，13 000 r/min离心30 min，取上清液，然后在96孔板中于每20～40 μg蛋白中加入90 μL相应的探针和10 μL相应的催化酶，37℃下培养2 h，最后通过酶标仪测定样品的吸光值确定Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。

1.9 統计学方法

用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAPT对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响

CCK-8法检测发现，使用不同浓度的DAPT处理后，在24～72 h时间范围内U2OS细胞增殖受到明显抑制，并且抑制作用呈剂量和时间相关依赖性，在浓度为5 μmol/L时即出现抑制细胞增殖的作用，且随着DAPT剂量的增加和作用时间的延长，其抑制效果也相应增加。各个浓度及作用时间对U2OS细胞活性的影响见图1。

2.2 DAPT对骨肉瘤U2OS细胞凋亡的影响

通过Annexin V-FITC和PI双染标记法结合流式细胞仪进行检测，结果显示，随着DAPT浓度的增加，凋亡率也逐渐升高，DAPT 5、10、20 μmol/L浓度组作用48 h后，其凋亡率分别为（10.1±1.8）%、（19.1±1.6）%、（31.3±3.1）%，与对照组（2.1±0.4）%相比，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。

2.3 Hoechst 33258染色法观察细胞形态学改变

荧光显微镜下显示对照组人骨肉瘤U2OS细胞核完整，着色均匀，荧光成弥散状，相对比较黯淡。DAPT组（5、10、20 μmol/L）处理48 h后，可见染色质凝聚，细胞核出现裂解，着色不规则且不均匀，部分浓染，呈现出细胞凋亡的典型变化即核碎裂，产生凋亡小体的征象。见图3（封四）。

2.4 DAPT诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡通路相关mRNA表达水平的改变

不同浓度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS细胞48 h后，采用RT-PCR检测细胞凋亡通路相关mRNA表达水平的改变。结果显示，DAPT能明显诱导U2OS细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。提示U2OS细胞经DAPT处理后发生了凋亡，且凋亡程度与其浓度呈正相关。见图4。

2.5 DAPT诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的改变

为进一步了解DAPT促凋亡的具体机制，本研究通过Western blot检测了Bax和Bcl-2表达水平的改变。结果显示，不同浓度DAPT（0、5、10、30 μmol/L）作用于U2OS细胞48 h后，促凋亡蛋白Bax的表达水平随DAPT浓度增加而逐渐升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则随DAPT浓度增加而逐渐下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图5。

2.6 DAPT对骨肉瘤U2OS细胞Caspase依赖的凋亡通路活性的影响

为进一步了解DAPT促进骨肉瘤细胞凋亡的具体机制，本研究探讨了其对Caspase凋亡通路的影响。结果显示，应用不同浓度的DAPT（0、5、10、20、30 μmol/L）作用于U2OS细胞48 h后，与对照组相比，5、10、20、30 μmol/L DAPT均能够提高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，且随着浓度的增加，其活性也不断增高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图6。endprint

3 讨论

Notch是一条相对保守的信号通路，其在多种肿瘤中均参与调控，究竟发挥抑癌还是促癌的作用，至今仍无定论。2004年，国外学者Kawakami等[14]首先报道了骨肉瘤患者Notch1高表达，随后国内外众多学者通过体外或体内研究纷纷表明Notch信号通路参与了骨肉瘤的增殖、分化、凋亡、耐药以及对骨肉瘤干细胞的调控，活化Notch信号通路对骨肉瘤起促癌作用等[15-17]。2009年，Tanaka等[18]研究表明，骨肉瘤患者标本中Notch2、Jagged1、HEY1和HEY2的表达增高，而使用γ-分泌酶抑制剂则能有效抑制体外骨肉瘤HOS和143B细胞的生长，同时也能有效抑制裸鼠移植瘤的生长，从而证实了γ-分泌酶抑制剂治疗骨肉瘤的有效性，但仅从周期抑制的角度阐述了γ-分泌酶抑制剂的作用机制。

前期研究发现，NICD1在骨肉瘤中高表达，NICD1与骨肉瘤的发生、发展关系密切[19]。γ-分泌酶抑制剂DAPT可以特异性地阻断Notch信号通路从而抑制骨肉瘤细胞的增殖[20]。本实验中，通过采用浓度梯度的Notch信号通路抑制剂DAPT体外作用于人骨肉瘤系U2OS，应用CCK-8试验检测发现，梯度浓度的DAPT可以有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，且细胞存活率与DAPT的作用浓度和时间呈正相关，当DAPT浓度为10 μmol/L，作用时间48 h时其抑制作用明显增强。与国内学者游浩等[17]研究结果相似，提示DAPT可以体外抑制骨肉瘤细胞的增殖，对骨肉瘤细胞起杀伤作用。

临床和基础研究均显示，凋亡与肿瘤的发生、发展有密切关系，诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤治疗有极为重要的意义。Annexin V-FITC和PI双染标记法结合流式细胞仪是常用的检测细胞凋亡的重要方法。结果显示，DAPT在体外诱导人骨肉瘤U2OS细胞发生凋亡，且其凋亡率随着DAPT浓度的增加而增加。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，与细胞核结合而发出蓝色荧光，常被用来进行凋亡细胞的形态学检测。通过荧光显微镜下观察显示5、10、20 μmol/L的DAPT可诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，细胞核出现固缩、碎裂，显现凋亡小体征象。这些结果都说明，Notch抑制剂可以有效诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。

在细胞凋亡的执行过程中，Caspase家族起着非常重要的作用，这种凋亡方式被简称为Caspase依赖的细胞凋亡途径。为进一步阐明DAPT诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡机制，通过Western blot检测了促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达情况，发现随着DAPT作用浓度的增高，Bax的表达逐渐增加，而Bcl-2的表达则逐渐降低，从而解除了对Caspase的抑制，导致细胞凋亡的发生。在本研究中，应用RT-PCR检测确实发现Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平随DAPT浓度增加而不断升高，其原因可能是Bax/Bcl-2比值升高，解除了对Caspase家族相关蛋白的抑制作用，激活了凋亡级联反应的发生。采用Caspase活性检测试剂盒检测不同浓度DAPT对Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性的影响，结果显示，U2OS细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性在加入DAPT处理后均不同程度明显增高，且随DAPT浓度的增加，其活性逐渐提高。这些结果均提示DAPT诱导的U2OS细胞凋亡与Caspase级联活化有关。

综上所述，Notch通路抑制剂DAPT对骨肉瘤U2OS细胞具有明显的抑制增殖并诱导细胞凋亡作用，DAPT可能通过Caspase依赖的凋亡途径对骨肉瘤U2OS细胞产生杀伤作用，其作用机制涉及促凋亡蛋白Bax表达增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下降，从而激活Caspase的凋亡通路，引发细胞凋亡的信号转导级联过程，最终导致细胞凋亡的发生。DAPT细胞毒性低，副作用较少，因而有望成为治疗骨肉瘤理想的靶向治疗药物，为骨肉瘤的治疗提供了新途径和新思路。

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（收稿日期：2017-05-17 本文编辑：程 铭）endprint