低温驯化对东北林蛙过冷却点及结冰点的影响

杨 斌 袁一田 陈 晨 肖向红 黄璞祎 柴龙会

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

低温驯化对东北林蛙过冷却点及结冰点的影响

杨 斌 袁一田 陈 晨 肖向红 黄璞祎 柴龙会*

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

为评价东北林蛙(Ranadybowskii)的耐寒性及其适应低温能力，并为其养殖、运输和暂养提供参考数据，本研究分别测定了25℃、4℃和0℃驯养条件下东北林蛙的过冷却点和结冰点。结果显示，东北林蛙过冷却点最低可达-2.6℃，最高为-1.4℃；结冰点最低可达-2.3℃，最高为-1.2℃；低温驯化可显著降低东北林蛙结冰点。基于本试验结果和相关文献分析表明，经过低温驯化的东北林蛙可通过升高血糖维持在-2℃左右的过冷却状态，其耐寒对策为避免冰冻；在东北林蛙的人工养殖越冬、暂养、运输过程中，应尽量控制在-1℃以上以防冻死或降低其食用品质。

东北林蛙；低温胁迫；过冷却点；结冰点

东北林蛙(Ranadybowskii)俗称蛤士蟆，因其肉质鲜美、营养丰富、雌蛙输卵管(蛤士蟆油)可入药，是我国东北地区重要的经济蛙类。林蛙养殖业甚至是我国北方部分地区的支柱产业。东北林蛙属于变温动物，受亚寒带寒冷的冬季气候影响长达5～6个月。东北林蛙可通过冬眠等一系列生理调节过程增强其抗寒性，以适应寒冷而漫长的冬季。

在昆虫耐寒性研究中，过冷却点(supercooling point，SCP)常作为一项重要指标来界定昆虫的耐寒性强弱[1]。昆虫过冷却是指温度低于昆虫体液结冰点(freezing point，FP)时，其体液仍能保持液体状态的现象[2]。实际上，许多变温动物，尤其是体重小于60 g的个体，能够保持过冷却状态[3]。生活在林区的北方合唱蛙(Pseudacristriseriatamaculata)过冷却点可达-3℃[4]。本研究拟通过分别测定25℃、4℃和0℃驯养条件下东北林蛙的过冷却点和结冰点，以期评价东北林蛙的耐寒性及其适应低温能力，并为其养殖、运输和储存提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

东北林蛙成体于2016年9月采自黑龙江省伊春地区，雄蛙体重19～21 g，雌蛙体重25～28 g；瑞士Precisa公司电子分析天平；海尔公司控温冰箱；美国CUSTOM BIOGENIC SYSTEMS公司 2101 Controlled Rate Freezing System程序降温仪。

1.2 实验分组及实验对象准备

将东北林蛙分为25℃组，4℃组、0℃组，均饲养在湿润的PP塑料盒内，分别置于25℃室温、4℃控温冰箱和0℃控温冰箱。其中4℃组和0℃组分别选取常温状态的东北林蛙，以每天大约降温1℃的速度，最终将其饲养温度分别控制在4℃和0℃。每个温度组随机选取雌雄各10只、驯养1周后进行实验。

1.3 过冷却点及结冰点的测量方法

将程序降温仪的温度传感器金属探头通过泄殖腔插入刚刚经过双毁髓的林蛙体内，并保持温度传感器处于其肝脏中心位置。将林蛙放入程序降温仪的冷冻室内，启动程序降温仪，使冷冻室以1℃/min的速率下降并维持在-10℃。随着程序降温仪冷冻室温度下降，其温度传感器也记录到蛙体温度下降曲线。当蛙体温度下降到0℃以下某一数值时，其体液开始形成冰晶而放热，蛙体温度又开始突然略微上升，此时相对较低的温度值即为过冷却点(SCP)；当蛙体温度升高并维持在某一数值一段时间后，体液开始结冰，不再放热，蛙体温度值又开始逐渐下降，此时下降之前所对应的温度值即为结冰点(FP)，试验结束，保存数据(图1)。

图1 东北林蛙过冷却点和结冰点的测量方法Fig.1 The method for measuring SCP and FP of Rana dybowskii

1.4 数据处理方法

采用SPSS 20.0.0对试验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，用Duncan检验法进行均值间多重比较，P<0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 低温驯化对东北林蛙过冷却点(SCP)的影响

东北林蛙过冷却点最低可达-2.6℃，最高为-1.4℃(表1)。低温驯化可降低东北林蛙过冷却点(图2)。无论是雄性还是雌性东北林蛙，0℃组与25℃组的过冷却点平均值比较接近，且均低于4℃组平均值。东北林蛙分别在0℃和4℃驯养条件下，同一温度组内雌雄之间的过冷却点差异不显著。

表1 不同驯养温度条件下东北林蛙的过冷却点和结冰点(℃，Mean±SD，n=10)

Tab.1 The supercooling points(SCP)，freezing points(FP)of Ranadybowskii domesticated under different temperature conditions

图2 低温驯化对东北林蛙过冷却点(SCP)的影响Fig.2 The effects of domestication by low temperature on SCP of Rana dybowskii 不同字母表示组间差异显著(P<0.05) Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05)

2.2 低温驯化对东北林蛙结冰点(FP)的影响

东北林蛙结冰点最低可达-2.3℃，最高为-1.2℃(表1)。0℃组雌性东北林蛙的结冰点最低，0℃组雄性与4℃组雌性的结冰点也较低，25℃组雌性与雄性的结冰点均为最高，低温驯化对东北林蛙结冰点有显著影响(图3)。东北林蛙分别在0℃和4℃驯养条件下，同一温度组内雌性的结冰点显著低于雄性。

图3 低温驯化对东北林蛙结冰点(FP)的影响Fig.3 The effects of domestication by low temperature on FP of Rana dybowskii 不同字母表示组间差异显著(P<0.05) Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05)

3 结论与讨论

变温脊椎动物适应0℃以下的低温环境采用的策略包括避冻对策(避免冰冻，freeze avoidance)和耐冻对策(耐受冰冻，freeze tolerance)[5]。避冻指机体在低温胁迫下，继续维持体内过冷却状态，阻止细胞外液结冰，使之免受冻伤的现象[5-6]。耐冻是指机体在低温条件下，忍耐细胞外液结冰而不死亡的现象[7]。

我国北方冬季漫长，天气寒冷，林蛙需要经历长达5～6个月的冬眠期度过严寒的冬季。杨翠军发现[8]，东北林蛙于4℃、0℃驯化10 d后，置于-1℃无水潮湿环境中，10 d后存活率仍可达到100%，置于-2℃无水潮湿环境中1～5 d，东北林蛙的存活率分别为100%、87%、53%、13%、0%。由此可知，-1℃是东北林蛙能较长时间耐受的低温，而-2℃是东北林蛙能短时间耐受的极限低温。基于此，本试验设置25℃组为对照组，4℃组、0℃组为低温驯化组。试验发现，经过0℃低温驯化1周后，雄性东北林蛙的过冷却点和结冰点分别可低至-2.2℃、-1.7℃，雌性的分别可低至-2.4℃、-2.3℃。这意味着东北林蛙体温低于-2℃，其体液将会结冰，且不能长期存活。由此说明东北林蛙不能忍受冰冻，但能维持过冷却状态，其耐寒对策为避冻对策。

避冻动物降低机体过冷却点和结冰点通常通过在体内积累渗透压调节物质，包括多元醇、糖和某些氨基酸[9-10]。Xiao[11]、李秀峰[12]等发现，随着环境温度降低，东北林蛙血糖水平逐步升高。本试验发现，低温驯化可显著降低东北林蛙结冰点，其原因可能正是因为其血糖水平升高。

生活在林区的蛙类其过冷却点一般高于-3℃，很大程度上是因为拥有潮湿的皮肤[4，13]。而锄足蟾(Scaphiopusbombifrons)穴居在相对干燥的土壤中避免冰冻，其过冷却点要更低，大约为-6℃[14]。东北林蛙群居冬眠，最适宜的场所是水深达1.5～2.0 m深水湾冰面下的河底石砾、草根或树根下，其周围是0℃以上的安静、缓慢的水流[15]。因此，东北林蛙过冷却点和结冰点虽然只有-2℃左右，但足以应对其冬眠栖居环境的低温，即使偶尔遭遇0℃左右的低温也能存活。

本试验结果还提示，在东北林蛙的人工养殖越冬、暂养、运输过程中，除了要将其体温控制在较低温度下以降低机体代谢率、减少损耗，还应尽量控制在-1℃以上以防冻死或降低其食用品质。

本试验在测量过冷却点及结冰点之前，为保障动物福利而将东北林蛙双毁髓处死后再测量，所得数值可能与冬眠状态下活蛙的稍有差异。

[1] 侯柏华，张润杰.桔小实蝇不同发育阶段过冷却点的测定[J].昆虫学报，2007，50(6)：638-643.

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The Effects of Cold Acclimation on Supercooling Point and Freezing Point ofRanadybowskii

Yang Bin Yuan Yitian Chen Chen Xiao Xianghong Huang Puyi Chai Longhui*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

To evaluate cold tolerance ofRanadybowskiiand its ability to adapt to low temperature，and provide reference data for the breeding，transportation and temporary rearing，we measured the supercooling point and freezing point of farm-rearedRanadybowskiiat 25℃，4℃ and 0℃.The results showed that the minimum supercooling point ofRanadybowskiicould reach-2.6℃，the highest was-1.4℃，and the freezing point could be as low as-2.3℃，the highest was-1.2℃，while cold acclimation could significantly reduce the freezing point.Based on our experimental results and review of literature we conclude that cold acclimatedRanadybowskiican maintain a metastable state of supercooling at about-2℃ by increasing blood sugar and belongs to the freeze-avoiding species.For artificial breeding ofRanadybowskiiin winter，temporary rearing and transport，the temperature should be above-1℃ for freeze avoidance and high-quality food should be prvoded.

Ranadybowskii；Low temperature stress；Supercooling point；Freezing point

稿件运行过程

2017-03-01

修回日期：2017-04-19

发表日期：2017-08-10

Q955

A

2310-1490(2017)03-487-04

国家级大学生创新训练项目(201510225085)；国家自然科学基金项目(31672309)

杨斌，男，21岁，本科生；主要从事野生动物生理生态学研究。

*通讯作者：柴龙会，E-mail：chailonghui@126.com