急性心肌梗死后心室重构相关基因的生物信息学分析

牛小伟　张晶晶　彭瑜　白明　张钲

[摘要] 目的 通过生物信息学分析探讨急性心肌梗死后心室重构的相关基因及功能。 方法 分析基因表达数据库中与心梗后心室重构有关的数据集。 结果 在GSE47495数据集中共筛选出611个差异表达基因（DEG）。在基因本体论分析中对DEG按照生物途径、分子功能、细胞定位注释。对DEG涉及的信号通路进行Pathway分析。蛋白与蛋白互相作用网络确定的核心基因有：酰基辅酶A氧化酶1（Acox1）、膜联蛋白A1（Anxa1）、凝血因子XⅢ A1链（F13a1）。药物筛选结果表明棕榈油、姜黄素可能调节这些基因。 结论 在心肌梗死后心室重构的发生过程中，出现表达变化的基因功能主要集中在代谢、细胞外基质、炎症、凝血方面，其中Acox1、Anxa1、F13a1可能发挥着重要作用，棕榈油、姜黄素可能调节这些基因，发挥改善心室重构的作用。

[关键词] 急性心肌梗死；心室重构；基因；生物信息学

[中图分类号] R54 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0030-04

Analyzing gene expression profiles in ventricular remodeling after myocardial infarction via bioinformatics methods

NIU Xiaowei1，2 ZHANG Jingjing3 PENG Yu2，4 BAI Ming2，4 ZHANG Zheng2，4

1.The First Clinical Medical College， Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 2.Gansu Key Laboratory of cardiovascular disease， Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 3.Baiyin Second People′s Hospital， Gansu Province， Baiyin 730900， China； 4.The Heart Center， the First Hospital of Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou 730000， China

[Abstract] Objective To identify the molecular mechanisms underlying ventricular remodeling after myocardial infarction using bioinformatics methods. Methods Microarray data about ventricular remodeling after myocardial infarction were searched from GEO database. Results The array data of GSE47495 were obtained. A total of 611 DEG were identified. Gene ontology analysis showed that the DEG significantly enriched in biological processes， molecular function， and cell component. Pathway analysis showed the DEGs were involved in signaling pathways. The top 3 hub genes， Acox1， Anxa1， and F13a1 were identified from protein-protein interaction network. Results from drug screening indicated that palm oil and curcumin may regulate the above genes. Conclusion During post infarction ventricular remodeling， the identified DEG are mainly enriched in metabolism， extracellular matrix， inflammation， and coagulation. The hub genes， Acox1， Anxa1， and F13a1 provid potential targets for treatment of ventricular remodeling. Palm oil and curcumin may improve the ventricular remodeling through the regulation of these genes.

[Key words] Acute myocardial infarction； Ventricular remodeling； Gene； Bioinformatics

有研究表明，急性心肌梗死（簡称“心梗”）患者在住院期间的病死率已有所下降[1]。然而，大量患者出院后却因心力衰竭反复住院，导致长期病死率仍处于较高水平[1-2]。心梗后继发的心室重构是心衰发生的主要机制[3-5]，表现为梗死区心肌坏死产生膨出，非梗死区心肌肥大、间质纤维化、心室壁增厚扩张[3-5]。既往研究表明，细胞凋亡、代谢障碍、神经激素系统紊乱、氧化应激、炎性反应、细胞外基质异常是心室重构发生过程中的重要机制[3-5]。尽管针对上述机制的血管紧张素转化酶抑制剂、β受体阻滞剂等药物，已在一定程度上改善了心室重构，但仍有相当比例的患者并发心力衰竭[2]。因此，继续深入认识心梗后心室重构的发生机制具有重要意义。生物信息学分析能系统了解不同组织在不同时间、不同生命状态的基因表达差异，并全面理解基因间的相互关系，从中找出关键治疗靶点[6]。本次研究拟从基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）[7]中获取与心梗后心室重构相关的基因表达谱，筛选出重要差异表达基因（differentially-expressed genes，DEG），并进行功能分析，以期为心室重构的防治提供新思路。endprint

1 材料与方法

1.1 基因芯片表达谱数据

从GEO数据库中下载GSE47495数据集。采用结扎大鼠冠状动脉的方法制作急性心梗的心室重构模型[8]，术后2个月根据纤维瘢痕面积≥40%分组，超声心动图检查证实与无心室重构组（n=12）相比，心室重构组（n=5）的左室舒张末压增高[（21.0±0.5） mmHg]（1 mmHg=0.133 kPa）、射血分数降低（23±3）%。按照Affymetrix公司的检测方法对左心室组织进行转录表达谱分析。基因芯片的探针注释信息来自GPL6247 [RaGene-1_0-st] Affymetrix Rat Gene 1.0 ST Array平台。

1.2 数据预处理及DEG筛选

首先通过R 3.3.1软件中的Bioconductor程序包对基因芯片数据使用robust multiarray average法进行背景校正、标准化和汇总，然后绘制箱线图评估芯片数据质量，最后对合格数据采用limma包进行差异表达值计算，并根据贝叶斯检验以及Benjamini-Hochberg算法进行显著性分析[8]。以变化倍数（fold change，FC）>1.3且错误发现率（false discovery rate，FDR）< 0.05为阈值选取DEG[9]。

1.3 基因本体论和通路分析

在注释、可视化和整合发现数据库（DAVID）中[10]，根据基因本体论（gene ontology，GO）分析，按照生物途径（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞定位（cellularcomponent，CC）对基因进行注释和分类[11]。同时根据京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）进行通路（Pathway）分析[12]。所有富集分析根据FDR值依次排序，分别列出前5名的基因注释信息。FDR值越小，越有理由相信该差异基因显著性地富集到某个注释中[8]。

1.4 蛋白相互作用分析

运用相互作用基因搜索工具数据库（STRING）构建DEG的蛋白与蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）[13]。选取可信度分数高于0.4的互作对导入Cytoscape 3.4.0软件[14]，使用MCODE插件对PPI进行基因簇划分[参数：节点度（degree cutoff）>5，邻节点个数（K-core）>2]，依据每个基因簇的评分筛选核心基因，并采用Pathway分析基因簇的功能[15]。

1.5 作用于分子靶点的药物筛选

在比较毒物遗传学数据库（CTD）中筛选能影响基因簇的药物，FDR值越小，表明药物对基因影响的可信度越高。

2 结果

2.1 DEG的筛选

对GSE47495数据预处理后，箱线图显示各样本中值基本保持在同一条直线上，说明数据已标准化。根据预先制定的阈值共筛选出611个DEG，其中上调448个，下调163个，聚类分析热图提示两组间的基因整体表达模式存在明显差异，同组之间各样本间的重复性较好（图1，封四）。

2.2 GO分析

GO数据库分别从分子功能、参与的生物途径及细胞中的定位对基因产物进行了标准化描述，即对基因产物进行了功能分类注释。DEG在BP中，主要富集在细胞外基质组织结构（GO_BP：0030198）、创伤反应（GO_BP：0009611）、脂肪酸代谢过程（GO_BP：00066 31）、药物反应（GO_BP：0042493）、细胞黏附（GO_BP：0007155）；在MF中，主要富集在结合模式（GO_MF：0001871）、多糖结合（GO_MF：0030247）、碳水化合物结合（GO_MF：0030246）、黏多糖结合（GO_MF：0005539）、钙离子结合（GO_MF：0005509）；在CC中，主要富集在细胞外区域（GO_CC：0005576）、细胞外基质蛋白（GO_CC：0005578）、细胞外基质（GO_CC：0031012）、胞外区组分（GO_CC：0044421）、胞外基质组分（GO_CC：0044420）。

2.3 Pathway分析

Pathway分析能明确显著改变的代谢通路。DEG涉及代谢通路主要有：细胞外基质受体相互作用（KEGG_ pathway： rno04512）、脂肪酸代谢（KEGG_pathway：rno00071）、黏着斑（KEGG_pathway：rno04510）、补体和凝血级联反应（KEGG_pathway：rno04610）、不饱和脂肪酸生物合成（KEGG_pathway：rno01040）。

2.4 PPI分析

PPI分析發现3个基因簇（图2），包括40个节点，连接度为185，核心基因分别为酰基辅酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，Acox1）、膜联蛋白A1（annexin A1，Anxa1）、凝血因子ⅩⅢ A1链（coagulation factor ⅩⅢ A1 chain，F13a1）。对基因簇的功能富集显示：3个基因簇分别主要参与脂肪酸代谢、补体和凝血级联反应、细胞外基质受体相互作用等通路。

2.5 针对基因簇的药物筛选

对上述3个基因簇采用CTD筛选，结果表明棕榈油和姜黄素对ACADM、ACADVL、ADCY7、ANXA1、F13A1、CYBB、DECR1、APLN、C1QC、C3AR1、TGFB2、EHHADH、CD68、HADHA、ECHDC2、TYROBP、VWF、FN1、ACOX1、CTSS、C1QA、C1QB、TIMP1具有调控作用（FDR < 0.05）（图3）。endprint

3 討论

心梗后心室重构是近年越来越受关注的学术热点问题[3-5]。既往已有研究收集了心衰与非心衰患者的心脏组织标本，采用基因芯片方法进行表达谱分析，结果提示与心衰相关的基因主要集中在线粒体功能、氧化磷酸化、细胞外基质方面[16-18]。然而这些研究结果大多来源于已进展至终末期心衰阶段的扩张型心肌病患者，采用的心脏标本也经过了长期大量的药物干预，难以准确反映心室重构自然发生过程中的基因表达谱变化。大鼠心梗模型具有良好的可重复性以及与人类疾病相似的变化过程，已被广泛应用于心血管疾病的研究[19]。在本次研究中，按照是否发生心室重构将急性心梗大鼠重新分组，有利于在较为自然的状态下，探索心室重构发生的相关基因表达谱，从而为早期防治提供参考。此外，通过R软件调用了标准limma包进行DEG筛选[8]，随后对DEG绘制热图，结果提示DEG能够将样本按照是否发生心室重构进行聚类，这些均说明本次研究对DEG的筛选过程可靠。综合GO分析和Pathway分析结果，本次研究发现DEG功能主要富集在代谢、细胞外基质、炎症、凝血方面。

STRING是目前使用最广泛的蛋白-蛋白互作关系数据库，可基于已有的研究知识与信息进行模型构建，展示数据的分子相互作用网络与机制。MCODE通过利用网络中蛋白之间固有的关系寻找基因簇，进而确定网络中的核心基因。在PPI分析中，本次研究通过共发现3个核心基因，即Acox1、Anxa1、F13a1。ACOX1是脂肪酸氧化的重要限速酶[20]。ANXA1是一种磷脂酶A2抑制蛋白[21]。F13A1是凝血因子ⅩⅢ的功能亚单位[22]。鉴于这些PPI分析中的基因簇可能成为改善心室重构的治疗靶点，本次研究继续使用CTD筛选治疗药物，结果提示棕榈油、姜黄素与这些基因簇的联系最密切。其中姜黄素对心室重构的保护作用已被较多研究支持[23]，但其机制仍未阐明，本项研究结果发现的相互作用基因，可能为其提供了新的机制思路。棕榈油是一种具有调节脂肪酸代谢紊乱的食用植物油[24]，其与心室重构的关系研究尚少，有待于未来研究证实，从而为心室重构的防治提供更多措施。

本次研究还存在以下局限性：首先，在GO分析和Pathway分析中，仅列出排在前5名的基因注释信息。虽然对其它FDR < 0.05的结果未能详细说明，但由于FDR值大小本身能反映出基因功能的重要性程度，对富集程度越高的生物学过程进行研究，可能会起到更好地效果[6]。其次，本次研究结果主要基于生物信息学分析，未进行实验验证。由于生命系统的复杂性以及各数据库的局限性，使得某些数据的解释可能会存在一定不足。

综上所述，本次研究运用生物信息学方法，从系统水平揭示了在心梗后心室重构的发生过程中，出现表达变化的基因功能主要集中在代谢、细胞外基质、炎症、凝血方面，其中Acox1、Anxa1、F13a1可能发挥着重要作用，棕榈油、姜黄素可能通过调节这些基因，成为改善心室重构的治疗药物。

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（收稿日期：2017-07-17 本文编辑：李岳泽）endprint